耿慶光，王 發(fā)

(陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安 710061)

奧硝唑是繼甲硝唑、替硝唑后上市的抗厭氧菌和抗滴蟲藥物，其抗厭氧菌和抗原生質(zhì)感染、抗毛滴蟲的作用均高于前兩者。臨床上用于毛滴蟲引起的男女泌尿生殖道感染，阿米巴原蟲引起的腸、肝阿米巴蟲病，賈第鞭毛蟲病，厭氧菌感染、術(shù)后感染和口腔感染等。奧硝唑的耐受性良好，不良應(yīng)較少，有皮膚過敏反應(yīng)、消化系統(tǒng)反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)反應(yīng)等［1－3]?！吨袊幍洹?010年版第二增補(bǔ)本奧硝唑片和膠囊采用自身對照法測定有關(guān)物質(zhì)［4]，限度為雜質(zhì)總量不得超過1．0%。但原料項下有關(guān)物質(zhì)的測定為:雜質(zhì)Ⅰ按外標(biāo)法以峰面積計算，不得超過0．2%，其它各雜質(zhì)和不得超過0．5%。為比較兩種方法之間的差異，我們對收集到的137批奧硝唑制劑(片劑和膠囊兩種劑型)按標(biāo)準(zhǔn)對有關(guān)物質(zhì)項進(jìn)行了測定，分別用主成分自身對照法和外標(biāo)法對雜質(zhì)Ⅰ進(jìn)行計算，結(jié)果自身對照法的計算結(jié)果比外標(biāo)法的大，為更加準(zhǔn)確的控制奧硝唑制劑中有關(guān)物質(zhì)的含量，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料［5－9]，建立了加校正因子的主成分自身對照法測定奧硝唑片和膠囊中有關(guān)物質(zhì)含量的方法，具體方法和結(jié)果如下。

1 儀器與試藥

1．1儀器 島津 LC-30AD色譜儀，UV檢測器，賽多利斯BBS-224S型電子分析天平。

1．2 試劑和樣品 雜質(zhì)Ⅰ對照品(2-甲基-5-硝基咪唑)，中檢所提供，批號:100512－200802，含量99．8%;奧硝唑?qū)φ掌?，中檢所提供，批號:100608－201102，含量100．0%;137批奧硝唑制劑分別由9個企業(yè)提供;試劑:甲醇為色譜純，水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱:Agilent C18(250 mm×4．6 mm，5μm);流動相:甲醇—水(20 ∶80);檢測波長:318 nm;柱溫:35℃，流速:1．0 mL·min－1，進(jìn)樣體積:20μL，記錄色譜圖至主峰保留時間的1．5倍。

2．2 溶液的制備

2．2．1 供試品溶液的制備 精密稱取供試品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于奧硝唑100 mg)，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻即得。

2．2．2 對照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻即得。

2．2．3 對照品溶液的制備 精密稱定雜質(zhì)Ⅰ對照品9．99 mg(實際含雜質(zhì)Ⅰ為9．97 mg)，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻，再精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻即得。

2．2．4 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的制備 取供試品溶液適量，加熱回流1 h，放冷至室溫，與對照品溶液1∶1混合即得。

2．3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取“2．2”項下系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，照“2．1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，各色譜峰分離度符合要求。典型色譜圖見圖1。

2．4 檢測限 取雜質(zhì)Ⅰ對照品溶液，用流動相逐步稀釋，按“2．1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，確定雜質(zhì)Ⅰ的檢測限為0．019 94 mg·L－1(信噪比約為3)。

2．5 重復(fù)性試驗 取奧硝唑片和膠囊各一批，分別測定6次，測得雜質(zhì)Ⅰ的含量分別為0．055%和0．039%，RSD 分別為1．9%和2．3%，表明方法重復(fù)性良好。

圖1 典型色譜圖

2．6 回收率試驗 精密稱取上述奧硝唑片和膠囊細(xì)粉適量(約含奧硝唑100 mg)6份，各精密加入對照品溶液250 μL(相當(dāng)于雜質(zhì)Ⅰ:0．05 μg)，按2．2項下方法制備相應(yīng)溶液，測定，按外標(biāo)法計算回收率，結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ的回收率為 99．1% 和 99．5%，RSD 為 3．3%和2．9%，表明方法回收率良好。

2．7 樣品的測定 按“2．2”項下方法，分別制備對照溶液、對照品溶液和樣品溶液，分別進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖至主峰保留時間的1．5倍。分別按照外標(biāo)法，主成分自身對照法對檢出的雜質(zhì)Ⅰ進(jìn)行計算。結(jié)果顯示主成分自身對照法的計算結(jié)果比外標(biāo)法的大，測定結(jié)果見圖2。

圖2 外標(biāo)法和自身對照法計算樣品中雜質(zhì)Ⅰ的結(jié)果比較

2．8 響應(yīng)因子的測定 精密稱奧硝唑?qū)φ掌?0．46 mg，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻，精密量取上述溶液和對照品貯備液各5 mL，同置50 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻。精密量取此混合溶液適量，用流動相稀釋成奧硝唑濃度為5．230 0、1．046 0、0．523 0、0．209 2、0．104 6 mg·L－1，雜質(zhì)Ⅰ濃度為4．985 0、0．997 0、0．498 5、0．199 4、0．099 7 mg·L－1的系列對照品溶液，即得校正因子系列濃度溶液。依上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄保留時間和峰面積，分別得到雜質(zhì)Ⅰ和奧硝唑的線性方程，將各線性方程的截距校正為0，得校準(zhǔn)方程的斜率。通過計算，得到的雜質(zhì)Ⅰ校正因子為 0．80(f=k奧硝唑/k雜質(zhì)Ⅰ);相對保留時間為0．23(RRT=tR雜質(zhì)/tR奧硝唑)。

表1 奧硝唑和雜質(zhì)Ⅰ的線性方程及校正因子

用校正因子對雜質(zhì)Ⅰ的峰面積進(jìn)行校正后計算，并與外標(biāo)法計算的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩者比較一致，測定結(jié)果見圖3。

圖3 外標(biāo)法和加校正因子的自身對照法計算樣品中雜質(zhì)Ⅰ的結(jié)果比較

3 討論

《中國藥典》2010年版附錄ⅪⅩF藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則指出:已知雜質(zhì)對主成分的相對響應(yīng)因子超出0．9～1．1范圍時，宜用對照品對照法計算含量，也可用經(jīng)驗證的相對響應(yīng)因子進(jìn)行校正后計算，未知雜質(zhì)的定量可用主成分的自身對照法計算［10]。本試驗測得的校正因子為0．8，因此采用主成分自身對照法測定奧硝唑制劑中雜質(zhì)Ⅰ的含量，會使其結(jié)果偏高。為了保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議將奧硝唑制劑中有關(guān)物質(zhì)檢查方法修改為:供試品溶液如檢出雜質(zhì)Ⅰ(相對保留時間為0．23)，采用加校正因子的主成分自身對照法對其峰面積進(jìn)行校正，校正因子為0．8，其他雜質(zhì)采用不加校正因子的主成分自身對照法計算，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于自身對照溶液主峰的面積(1．0%)，以更準(zhǔn)確的反映奧硝唑制劑中雜質(zhì)的含量。

［1] 方正明，呂 紅，姚 藍(lán)．奧硝唑不同劑型抗陰道毛滴蟲作用的比較研究［J]．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010，10(11):1274 －1276．

［2] 呂 紅，方正明，龔凡榮，等．奧硝唑凝膠劑體內(nèi)外抗陰道毛滴蟲作用［J]．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(14):1203 －1206．

［3] 劉柳芳，黃文榮，李雪飛．奧硝唑?qū)ρ乐苎谆颊忒熜б约把装Y因子影響的臨床價值分析［J]．醫(yī)學(xué)綜述，2014，20(9):1703－1705．

［4] 國家藥典委員會．中國藥典(第二增補(bǔ)本)［S]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:334－335．

［5] 魏嘉陵，林暢偉．用加校正因子的主成分自身對照法測定苯扎貝特中雜質(zhì)氯苯酪胺的含量［J]．藥物分析雜志，2006，26(12):1848－1850．

［6] 郭福團(tuán)．加校正因子的主成分自身對照法測定鹽酸苯海拉明片中有關(guān)物質(zhì)的含量［J]．海峽藥學(xué)，2013，25(10):47 －49．

［7] 左文飛，潘 娜，范雪平．泮托拉唑鈉雜質(zhì)校正因子的測定［J]．中國藥學(xué)雜志，2012，47(24):2029 －2031．

［8] 莊賀飛，孟 夏，袁 楊，等．加校正因子的主成分自身對照法測定復(fù)方奧美拉唑咀嚼片中有關(guān)物質(zhì)的含量［J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(9):131 －135．

［9] 馬春靖，閆 冬，姚宏濤，等．加校正因子的主成分自身對照法測定賴諾普利氫氯噻嗪片中有關(guān)物質(zhì)的含量［J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20(20):86 －90．

［10]國家藥典委員會．中國藥典(二部)［S]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:205．