仲 達，王 艷

(1．海南衛(wèi)康制藥(潛山)有限公司，安徽安慶 246300;2．天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 300193)

山茱萸(cornus officinalis sieb．et zuce)是山茱萸科植物山茱萸的成熟果肉，其成熟后的果實去核后又名山萸肉、藥棗、棗皮等，為名貴中藥材，具有較高的藥用和滋補價值［1]。其味酸、澀，性微溫，有澀精、斂汗、補肝腎的功能。山茱萸主要含有環(huán)烯醚萜苷類、多糖、有機酸、鞣質(zhì)等成分［2]。大量研究表明，山茱萸總苷具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性和消炎、抗癌、降血糖、強心等作用。我們的研究表明山茱萸醇提液可通過抑制骨吸收和促進骨形成等途徑，使機體骨代謝處于骨形成大于骨吸收的正平衡狀態(tài)，抑制骨量丟失，防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生［3－4]。本研究采用50%乙醇對山茱萸治療骨質(zhì)疏松效應成分進行提取［3－4]，建立其醇提物的高效液相(HPLC)指紋圖譜，并其色譜峰進行相似度、主成分分析和聚類分析，探討山茱萸骨質(zhì)疏松效應的主要成分，為其物質(zhì)基礎研究奠定依據(jù)，同時也為其藥材質(zhì)量控制提供一定參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1．1 儀器 Aglienl－1200四元泵全自動進樣液相色譜儀包括DAD檢測器、自動進樣器、在線脫氣、四元泵(美國安捷倫科技公司)。

1．2 材料 10批不同產(chǎn)地的山茱萸藥材分別購于河南省、陜西省、浙江省等不同產(chǎn)地、不同時間采集加工，并經(jīng)天津中醫(yī)藥大學馬琳教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，藥材來源見表1。

馬錢苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111640－200604);莫諾苷對照品(天津馬克生物制品有限公司，純度99．19%);甲醇為色譜純(天津江天化工技術有限公司);乙腈為色譜純(上海泰瑞爾化學有限公司);其余均為分析純;水為重蒸餾水。

表1 山茱萸樣品來源

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱:Accurasil C18高效液相色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5μm);流動相:A 為乙腈—0．15%的磷酸水溶液梯度洗脫，乙腈在0～20 min為9%，20～35 min為9% ～17%，35～60 min為17% ～27%;柱溫:30℃;流速:1 mL·min－1;進樣量為10μL;檢測波長為217 nm。

2．2 供試品溶液的制備［3－6]稱取山茱萸藥材樣品粉末5 g(過3號篩)，置于250 mL圓底燒瓶中，加入50%乙醇40 mL，回流提取3次，每次3 h，濾過，合并濾液，濾液揮干，加0．15%的磷酸水溶解，置5 mL量瓶中，再加0．15%的磷酸水至刻度，搖勻。

2．3 對照品溶液的配制 稱取莫諾苷約5 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0．976 g·L－1的對照品儲備液。取馬錢苷約5 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0．997 g·L－1的對照品儲備液。取以上兩個對照溶液各1 mL于5 mL量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，得混標溶液。

2．4 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液，按上述的色譜條件重復進樣5次，結(jié)果12個共有峰的相對保留時間的RSD%均小于0．85%，相對峰面積的RSD%均小于1．7%，符合指紋圖譜技術要求。

2．5 穩(wěn)定性試驗 分別取同一份供試品溶液，按照上述的提取工藝制備供試品，采用上述的色譜條件，在0、4、8、12 h 進樣，測定，結(jié)果 12 個共有峰的相對保留時間的RSD%均小于0．8%，相對峰面積的RSD%均小于1．92%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．6 重現(xiàn)性試驗 取同一批次供試品，按“2．3”項下方法分別制備5份供試品，分別進樣測定，結(jié)果12個共有峰的相對保留時間的RSD%均小于0．85%，相對峰面積的RSD%均小于1．84%，符合指紋圖譜技術規(guī)定。

2．7 供試品測定與相似度分析 按“2．1”項下供試品溶液的制備方法處理，在“2．3”項色譜條件下，分別制備10批山茱萸藥材的供試品溶液，精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，進樣，測定，記錄各批圖譜。對照品溶液和樣品溶液的HPLC圖，見圖1、2。確定12個共有峰。其中3號峰為莫諾苷，7號峰為馬錢苷。相似度分析:運用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A》軟件進行分析，相似度在0．748～0．919之間。結(jié)果見表2。

圖1 莫諾苷、馬錢苷混合標準液的HPLC色譜圖

圖2 10批山茱萸提取液的HPLC指紋圖譜

表2 指紋圖譜共有模式的10批山茱萸樣品的相似度計算結(jié)果

2．8 山茱萸共有峰的相對保留時間和相對峰面積

選擇馬錢苷為內(nèi)參照峰(S)，以其保留時間和峰面積值為1，計算各樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果見表3、表4。2．9 聚類分析 將原始數(shù)據(jù)代入SPSS17．0進行主成分分析，結(jié)果見表5、6。從表5中可以看到79．482%的貢獻來自前2個主成分，即當提取的主成分數(shù)為2時，累計的貢獻率已達79．482%，基本保留了原樣本的信息。所以確定提取的主成分數(shù)為2個。從表6中可以看到主成分1相關系數(shù)較接近1，運用SIMCA-P11．5提取兩個主成分，根據(jù)主成分1的得分值對樣品進行優(yōu)劣排序，結(jié)果見表7?？梢娭鞒煞值梅衷礁?，樣品性質(zhì)或特征的相似程度最好，即6號樣品的質(zhì)量最優(yōu)。

表3 山茱萸指紋圖譜共有峰相對保留時間

表4 山茱萸指紋圖譜共有峰相對峰面積

為了驗證綜合主成分分析結(jié)果的可靠性及客觀性，將原始數(shù)據(jù)代入SPSS17．0軟件，對原始樣本數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析［11]，結(jié)果見圖3。10個山茱萸樣本基本可以分為兩類，即較優(yōu)品與一般品。其中6、7樣品為一類并與1號樣品聚為一類，在綜合主成分排序中分別占了第1、2、3位，所以為較優(yōu)品;在剩下的一般品中還可以看出 3、5、9、2、8 是一類，在綜合主成分排序中分別占了第 8、9、10、7、6位，質(zhì)量較差。3、5、9、2、8 和4 又可以成為一類，以此類推，余下的3、5、9、2、8、4、10 號樣品聚為一類，為一般品。由主成分分析和系統(tǒng)聚類分析可見兩者的結(jié)果基本一致，說明綜合主成分較全面地表征了原始樣本的信息。

表5 特征根、各主成分的貢獻率

表6 主成分各因子相關系數(shù)

表7 主成分得分值及綜合優(yōu)劣排序

圖3 樣品的聚類分析圖

3 討論

根據(jù)前期的藥效學實驗結(jié)果，我們對10批山茱萸藥材50%乙醇提取物進行了相似度評價，其結(jié)果的比較采用國家藥典委員會開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(A版)，指定參照圖譜為10號樣品圖譜。因為10號樣品在10批樣品的圖譜中在出峰數(shù)目，峰形及分離度方面比較適中。采用中位數(shù)作為對照圖譜生成方法，時間窗寬度設為0．60，運用夾角余弦法對各批次山茱萸樣品計算相似度結(jié)果見表5。從相似度計算結(jié)果可以看出，相似度在0．748 ～0．919 之間。

我們又對10批山茱萸藥材進行了主成分分析和系統(tǒng)聚類分析，主因子分析的目的之一是用盡可能少的因子來解釋觀測到的變量，主成分的特征根及貢獻率是選擇主成分的依據(jù)，從表5中可以看到79．482%的貢獻來自前2個因子，基本保留了原樣本的信息，所以確定提取的主成分數(shù)為2個。從表6中可以看到主成分1相關系數(shù)較大，所以主成分1對山茱萸藥材的影響最大，而在主成分1中峰7系數(shù)值最大，峰11系數(shù)次之，說明山茱萸中峰7(馬錢苷)含量最高。根據(jù)主成分1的得分值對樣品進行優(yōu)劣排序，6號樣品排名第一主要是主成分1的得分較高，峰7、峰8、峰9、峰11的主成分值較大引起。一般認為主成分得分越高，樣品性質(zhì)或特征的相似程度最好，因此，以6號樣品的質(zhì)量最優(yōu)。

為了驗證綜合主成分分析結(jié)果的可靠性及客觀性，我們又將山茱萸各共有峰的原始數(shù)據(jù)進行了系統(tǒng)聚類分析。10個山茱萸樣本基本可以分為兩類，即較優(yōu)品與一般品。其中6、7樣品為一類并與1號樣品聚為一類，在綜合主成分排序中分別占了第1、2、3位，所以為較優(yōu)品;在剩下的一般品中還可以看出3、5、9、2、8 是一類，在綜合主成分排序中分別占了第8、9、10、7、6 位，質(zhì)量較差。3、5、9、2、8 和4又可以成為一類，以此類推。余下的 3、5、9、2、8、4、10號樣品聚為一類，為一般品。主成分評價結(jié)果與系統(tǒng)聚類法一致，其質(zhì)量排序結(jié)果具有一定的客觀性，值得后期山茱萸藥材總苷類化合物血清指紋圖譜參考。

通過本文結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，主成分分析方法用于中藥質(zhì)量的評價是切實可行的。本文的評價指標都是基于中藥樣本的共有有效成分的相對含量，但是中藥的質(zhì)量評價最終還是應以效果為先，所以在獲取多個藥效指標數(shù)據(jù)的前提下，主成分評價法的指標可以是相應的多個藥效指標，相關的研究工作還將繼續(xù)。

［1] 國家藥典委員會．中國藥典［S]．北京:化學工業(yè)出版社，2005:249．

［2] 江蘇新醫(yī)學院《中藥大辭典》編寫組．中藥大辭典［M]．上海:上?？茖W技術出版社，2003:189－190．

［3] 李 平，李 晶，王惠明．山茱萸對去勢大鼠骨代謝和骨密度影響的實驗研究［J]．天津中醫(yī)藥，2007，24(4):315 －317．

［4] 李 晶，武峻艷，王慧明，等．山茱萸對去勢大鼠骨組織形態(tài)學影響的實驗研究［J]．上海中醫(yī)藥雜志，2010，44(1):69 －72．