仲 達(dá)，王 艷

(1．海南衛(wèi)康制藥(潛山)有限公司，安徽安慶 246300;2．天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193)

山茱萸(cornus officinalis sieb．et zuce)是山茱萸科植物山茱萸的成熟果肉，其成熟后的果實(shí)去核后又名山萸肉、藥棗、棗皮等，為名貴中藥材，具有較高的藥用和滋補(bǔ)價(jià)值［1]。其味酸、澀，性微溫，有澀精、斂汗、補(bǔ)肝腎的功能。山茱萸主要含有環(huán)烯醚萜苷類、多糖、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等成分［2]。大量研究表明，山茱萸總苷具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性和消炎、抗癌、降血糖、強(qiáng)心等作用。我們的研究表明山茱萸醇提液可通過抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成等途徑，使機(jī)體骨代謝處于骨形成大于骨吸收的正平衡狀態(tài)，抑制骨量丟失，防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生［3－4]。本研究采用50%乙醇對(duì)山茱萸治療骨質(zhì)疏松效應(yīng)成分進(jìn)行提?。?－4]，建立其醇提物的高效液相(HPLC)指紋圖譜，并其色譜峰進(jìn)行相似度、主成分分析和聚類分析，探討山茱萸骨質(zhì)疏松效應(yīng)的主要成分，為其物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定依據(jù)，同時(shí)也為其藥材質(zhì)量控制提供一定參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1．1 儀器 Aglienl－1200四元泵全自動(dòng)進(jìn)樣液相色譜儀包括DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣、四元泵(美國(guó)安捷倫科技公司)。

1．2 材料 10批不同產(chǎn)地的山茱萸藥材分別購(gòu)于河南省、陜西省、浙江省等不同產(chǎn)地、不同時(shí)間采集加工，并經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，藥材來(lái)源見表1。

馬錢苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111640－200604);莫諾苷對(duì)照品(天津馬克生物制品有限公司，純度99．19%);甲醇為色譜純(天津江天化工技術(shù)有限公司);乙腈為色譜純(上海泰瑞爾化學(xué)有限公司);其余均為分析純;水為重蒸餾水。

表1 山茱萸樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱:Accurasil C18高效液相色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5μm);流動(dòng)相:A 為乙腈—0．15%的磷酸水溶液梯度洗脫，乙腈在0～20 min為9%，20～35 min為9% ～17%，35～60 min為17% ～27%;柱溫:30℃;流速:1 mL·min－1;進(jìn)樣量為10μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm。

2．2 供試品溶液的制備［3－6]稱取山茱萸藥材樣品粉末5 g(過3號(hào)篩)，置于250 mL圓底燒瓶中，加入50%乙醇40 mL，回流提取3次，每次3 h，濾過，合并濾液，濾液揮干，加0．15%的磷酸水溶解，置5 mL量瓶中，再加0．15%的磷酸水至刻度，搖勻。

2．3 對(duì)照品溶液的配制 稱取莫諾苷約5 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0．976 g·L－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取馬錢苷約5 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0．997 g·L－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取以上兩個(gè)對(duì)照溶液各1 mL于5 mL量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，得混標(biāo)溶液。

2．4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，按上述的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD%均小于0．85%，相對(duì)峰面積的RSD%均小于1．7%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2．5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取同一份供試品溶液，按照上述的提取工藝制備供試品，采用上述的色譜條件，在0、4、8、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果 12 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD%均小于0．8%，相對(duì)峰面積的RSD%均小于1．92%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批次供試品，按“2．3”項(xiàng)下方法分別制備5份供試品，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD%均小于0．85%，相對(duì)峰面積的RSD%均小于1．84%，符合指紋圖譜技術(shù)規(guī)定。

2．7 供試品測(cè)定與相似度分析 按“2．1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，在“2．3”項(xiàng)色譜條件下，分別制備10批山茱萸藥材的供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，進(jìn)樣，測(cè)定，記錄各批圖譜。對(duì)照品溶液和樣品溶液的HPLC圖，見圖1、2。確定12個(gè)共有峰。其中3號(hào)峰為莫諾苷，7號(hào)峰為馬錢苷。相似度分析:運(yùn)用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》軟件進(jìn)行分析，相似度在0．748～0．919之間。結(jié)果見表2。

圖1 莫諾苷、馬錢苷混合標(biāo)準(zhǔn)液的HPLC色譜圖

圖2 10批山茱萸提取液的HPLC指紋圖譜

表2 指紋圖譜共有模式的10批山茱萸樣品的相似度計(jì)算結(jié)果

2．8 山茱萸共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

選擇馬錢苷為內(nèi)參照峰(S)，以其保留時(shí)間和峰面積值為1，計(jì)算各樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果見表3、表4。2．9 聚類分析 將原始數(shù)據(jù)代入SPSS17．0進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表5、6。從表5中可以看到79．482%的貢獻(xiàn)來(lái)自前2個(gè)主成分，即當(dāng)提取的主成分?jǐn)?shù)為2時(shí)，累計(jì)的貢獻(xiàn)率已達(dá)79．482%，基本保留了原樣本的信息。所以確定提取的主成分?jǐn)?shù)為2個(gè)。從表6中可以看到主成分1相關(guān)系數(shù)較接近1，運(yùn)用SIMCA-P11．5提取兩個(gè)主成分，根據(jù)主成分1的得分值對(duì)樣品進(jìn)行優(yōu)劣排序，結(jié)果見表7。可見主成分得分越高，樣品性質(zhì)或特征的相似程度最好，即6號(hào)樣品的質(zhì)量最優(yōu)。

表3 山茱萸指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 山茱萸指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

為了驗(yàn)證綜合主成分分析結(jié)果的可靠性及客觀性，將原始數(shù)據(jù)代入SPSS17．0軟件，對(duì)原始樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析［11]，結(jié)果見圖3。10個(gè)山茱萸樣本基本可以分為兩類，即較優(yōu)品與一般品。其中6、7樣品為一類并與1號(hào)樣品聚為一類，在綜合主成分排序中分別占了第1、2、3位，所以為較優(yōu)品;在剩下的一般品中還可以看出 3、5、9、2、8 是一類，在綜合主成分排序中分別占了第 8、9、10、7、6位，質(zhì)量較差。3、5、9、2、8 和4 又可以成為一類，以此類推，余下的3、5、9、2、8、4、10 號(hào)樣品聚為一類，為一般品。由主成分分析和系統(tǒng)聚類分析可見兩者的結(jié)果基本一致，說明綜合主成分較全面地表征了原始樣本的信息。

表5 特征根、各主成分的貢獻(xiàn)率

表6 主成分各因子相關(guān)系數(shù)

表7 主成分得分值及綜合優(yōu)劣排序

圖3 樣品的聚類分析圖

3 討論

根據(jù)前期的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們對(duì)10批山茱萸藥材50%乙醇提取物進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，其結(jié)果的比較采用國(guó)家藥典委員會(huì)開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(A版)，指定參照?qǐng)D譜為10號(hào)樣品圖譜。因?yàn)?0號(hào)樣品在10批樣品的圖譜中在出峰數(shù)目，峰形及分離度方面比較適中。采用中位數(shù)作為對(duì)照?qǐng)D譜生成方法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0．60，運(yùn)用夾角余弦法對(duì)各批次山茱萸樣品計(jì)算相似度結(jié)果見表5。從相似度計(jì)算結(jié)果可以看出，相似度在0．748 ～0．919 之間。

我們又對(duì)10批山茱萸藥材進(jìn)行了主成分分析和系統(tǒng)聚類分析，主因子分析的目的之一是用盡可能少的因子來(lái)解釋觀測(cè)到的變量，主成分的特征根及貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù)，從表5中可以看到79．482%的貢獻(xiàn)來(lái)自前2個(gè)因子，基本保留了原樣本的信息，所以確定提取的主成分?jǐn)?shù)為2個(gè)。從表6中可以看到主成分1相關(guān)系數(shù)較大，所以主成分1對(duì)山茱萸藥材的影響最大，而在主成分1中峰7系數(shù)值最大，峰11系數(shù)次之，說明山茱萸中峰7(馬錢苷)含量最高。根據(jù)主成分1的得分值對(duì)樣品進(jìn)行優(yōu)劣排序，6號(hào)樣品排名第一主要是主成分1的得分較高，峰7、峰8、峰9、峰11的主成分值較大引起。一般認(rèn)為主成分得分越高，樣品性質(zhì)或特征的相似程度最好，因此，以6號(hào)樣品的質(zhì)量最優(yōu)。

為了驗(yàn)證綜合主成分分析結(jié)果的可靠性及客觀性，我們又將山茱萸各共有峰的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)聚類分析。10個(gè)山茱萸樣本基本可以分為兩類，即較優(yōu)品與一般品。其中6、7樣品為一類并與1號(hào)樣品聚為一類，在綜合主成分排序中分別占了第1、2、3位，所以為較優(yōu)品;在剩下的一般品中還可以看出3、5、9、2、8 是一類，在綜合主成分排序中分別占了第8、9、10、7、6 位，質(zhì)量較差。3、5、9、2、8 和4又可以成為一類，以此類推。余下的 3、5、9、2、8、4、10號(hào)樣品聚為一類，為一般品。主成分評(píng)價(jià)結(jié)果與系統(tǒng)聚類法一致，其質(zhì)量排序結(jié)果具有一定的客觀性，值得后期山茱萸藥材總苷類化合物血清指紋圖譜參考。

通過本文結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，主成分分析方法用于中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)是切實(shí)可行的。本文的評(píng)價(jià)指標(biāo)都是基于中藥樣本的共有有效成分的相對(duì)含量，但是中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)最終還是應(yīng)以效果為先，所以在獲取多個(gè)藥效指標(biāo)數(shù)據(jù)的前提下，主成分評(píng)價(jià)法的指標(biāo)可以是相應(yīng)的多個(gè)藥效指標(biāo)，相關(guān)的研究工作還將繼續(xù)。

［1] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典［S]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:249．

［2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院《中藥大辭典》編寫組．中藥大辭典［M]．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2003:189－190．

［3] 李 平，李 晶，王惠明．山茱萸對(duì)去勢(shì)大鼠骨代謝和骨密度影響的實(shí)驗(yàn)研究［J]．天津中醫(yī)藥，2007，24(4):315 －317．

［4] 李 晶，武峻艷，王慧明，等．山茱萸對(duì)去勢(shì)大鼠骨組織形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J]．上海中醫(yī)藥雜志，2010，44(1):69 －72．