吳 菲，姜 玲，方 明，陳飛虎，葛金芳

(1．安徽省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230001;2．安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y，常常發(fā)病于小孩，臨床中發(fā)現(xiàn)部分患者的腫瘤可以進(jìn)一步分化成熟，甚至自主消失，因此被稱為是誘導(dǎo)分化的標(biāo)準(zhǔn)模型。全反式維甲酸(ATRA)是一類經(jīng)典的細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑，可在體外誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化成熟［1]，不過因為它不易溶于水、不良反應(yīng)多等多種原因，它的深層次研究也被諸多的因素局限。在實驗前期，我們通過改造它的極性基團(tuán)，合成出一系列新型的維甲酸衍生物［2]，其中一種衍生物ATPR在抑制腫瘤細(xì)胞株增殖以及誘導(dǎo)分化上有著極強(qiáng)的生物學(xué)活性［3－4]。本研究通過觀察 SH-SY5Y 在 ATPR 作用前后增殖以及分化的變化情況，并同步觀察RARβ mRNA的表達(dá)，研究它的相關(guān)分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞株材料及主要試劑 細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理實驗室饋贈。主要試劑:DMEM培養(yǎng)液來源于Hyclone公司;小牛血清來源于鄭州九龍生物制品有限公司;青霉素購自杭州民生藥業(yè)有限公司;鏈霉素購自上海源葉生物科技有限公司;ATRA、二甲基亞砜、MTT、溴化乙錠、核糖核酸酶、碘化丙啶(PI)購自Sigma公司;鼠抗人NSE抗體購自北京博奧森生物科技有限公司;免疫組化二抗試劑盒購自上海金標(biāo)生物科技有限公司;PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒均為Promage公司產(chǎn)品。

1．2 細(xì)胞分組及培養(yǎng) SH-SY5Y在37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)。主要分組為:溶劑對照組(含0．05%無水乙醇)，空白對照組(加入等體積DMEM 培養(yǎng)基)，ATPR 組(10－9～10－4mol·L－1)，維甲酸陽性對照組(10－5mol·L－1)。

1．3 MTT法檢測抑制率 于96孔培養(yǎng)板中接種每毫升1×104個濃度的細(xì)胞。72 h培養(yǎng)之后，向其添加20μLMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除去上層清液，并于每孔中添加150μL的DMSO，混合均勻，置于酶聯(lián)免疫檢測儀上用490 nm的波長測定，并用試劑對照組進(jìn)行校零，每組設(shè)置5個復(fù)孔，重復(fù)3次實驗，得到數(shù)據(jù)，取平均值。

1．4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 六孔板中每毫升分別接種1×104個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后用 ATPR(10－9～10－5mol·L－1)、陽性對照藥 ATRA 10－5mol·L－1、等體積的DMEM的空白對照以及含0．05%無水乙醇的溶劑對照組加在每個孔內(nèi)，于10%FCS的DMEM培養(yǎng)體系中培育。72 h后，收集玻片，甲醛溶液固，染液染色，運用顯微鏡查看相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)，并進(jìn)行拍照記錄。

1．5 細(xì)胞分化的檢測 在六孔板中每毫升分別接種1×104個細(xì)胞，給藥方法同“1．4”項下，72 h后，于37℃的PBS中漂洗，在4℃環(huán)境下用多聚甲醛固定20 min，再次漂洗，加入3%H2O2在室溫中避光反應(yīng)10 min，充分洗滌，隨后在濕盒中將BSA添加于蓋玻片上，繼續(xù)反應(yīng)30 min，將1∶400比例稀釋后的糖分解烯醇酶－抗作用液滴加至各組蓋玻片上，37℃培養(yǎng)1 h，PBS振蕩清洗。用相應(yīng)的二抗(IgG/Bio)在常溫中反應(yīng)30 min至1 h，振蕩清洗，滴加鏈霉卵白素(SABC)，常溫培養(yǎng)20～30 min，PBS漂洗3次，最后用DAB顯色5～10 min，蒸餾水漂洗，乙醇脫水，二甲苯進(jìn)行透過操作，使用中性樹脂密封，置于顯微鏡下進(jìn)行查看，并拍照留存。實驗過程中以2%BSA代替一抗作為陰性對照。

1．6 細(xì)胞DNA倍體分析 細(xì)胞培養(yǎng)以及給藥同“1．4”，用PBS清洗2次，70%冰乙醇 －20℃冰箱固定過夜的方法處理收集到的細(xì)胞，細(xì)胞離心棄上層清液，并對所剩物用PI 100 mg·L－1以及RNase 50 mg·L－1，在4℃避光環(huán)境下染色30 min。采用流式細(xì)胞儀并利用modfitLT分析軟件對3×104以上細(xì)胞進(jìn)行周期分析。

1．7 RT-PCR 根據(jù)實驗的需要，設(shè)置分組為:加有等量體積的DMEM的空白對照組、加有0．05%無水乙醇的溶劑對照組、加有 ATRA 10－5mol·L－1的陽性對照組以及加有 ATPR 10－5mol·L－1的實驗組。反應(yīng)3 d后采集細(xì)胞，進(jìn)而檢測ATPR對細(xì)胞中的RARβ的效果。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min，變性 40 s，50 ℃ (RARβ)、56 ℃(GAPDH)，退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)后72℃延伸10 min。進(jìn)行3次實驗，并用其結(jié)果平均值進(jìn)行分析。

1．8 統(tǒng)計分析 利用SPSS 13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，其中數(shù)據(jù)都采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組資料之間的比較采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用 LSD-t檢驗的方法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 ATPR在細(xì)胞增殖中的影響 不同濃度的ATPR作用細(xì)胞72 h后，我們發(fā)現(xiàn)ATPR能抑制細(xì)胞的增殖，其中，10－4mol·L－1抑制效應(yīng)最明顯，最大抑制率達(dá)79．3%。和空白組相比，溶劑對照組A490變化不明顯，進(jìn)一步證明細(xì)胞增殖變化的差異受無水乙醇溶劑的影響較小，見表1。

表1 ATPR對SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響

2．2 細(xì)胞形態(tài)觀察 SH-SY5Y反應(yīng)時間72 h于吉姆薩染料染色后，在倒置顯微鏡下觀測:空白組細(xì)胞大部分都是呈小梭形，部分呈淚滴形、三角形狀。ATPR實驗組可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞慢慢形成相似于樹突、軸突的神經(jīng)突出，細(xì)胞整體的形狀也逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榻墒斓念惗噙呅螒B(tài)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。隨藥物濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)的改變越明顯，其中，10－5mol·L－1的濃度最顯著(圖1)。

2．3 分化指標(biāo)的檢測 我們通過免疫學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)NSE表達(dá)發(fā)生變化，對照組反應(yīng)產(chǎn)物為分布不均勻的淺棕色細(xì)小顆粒，顯色幾乎呈陰性。而使用藥物72 h后，免疫反應(yīng)顯色由陰性轉(zhuǎn)變成陽性，產(chǎn)物變成深棕色，大部分存在于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，近核位置分布偏多，在細(xì)胞核的內(nèi)部同樣存在大小不一的細(xì)小產(chǎn)物。同時檢測發(fā)現(xiàn)，增大藥物濃度，神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)增多，當(dāng)藥物濃度達(dá)到10－5mo·L－1時，表現(xiàn)最明顯(圖2)。

圖1 不同濃度ATPR作用于SH-SY5Y細(xì)胞72 h形態(tài)學(xué)變化(400×)

圖2 不同濃度ATPR作用于SH-SY5Y細(xì)胞NSE的影響

2．4 細(xì)胞DNA倍體變化 藥物作用SH-SY5Y細(xì)胞72 h后，與空白組相比，我們發(fā)現(xiàn) ATPR 10－5、10－6mol·L－1G1期細(xì)胞同步上升，所占的百分比也有明顯的提升，相應(yīng)的差異符合統(tǒng)計學(xué)要求(P＜0．01)，ATPR 10－5mol·L－1S 期的細(xì)胞相對減少，相應(yīng)的差異符合統(tǒng)計學(xué)要求(P＜0．01)，此外，G2/M期細(xì)胞基本不變，細(xì)胞周期進(jìn)程受到影響，并且在G0/G1期停留。詳細(xì)情況如圖3所示。

2．5 ATPR對SH-SY5Y細(xì)胞中RARβ的影響

圖3 不同濃度ATPR對SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響

ATPR(10－5mol·L－1)作用 72 h 后，SH-SY5Y細(xì)胞的RARβmRNA表達(dá)量增加，加藥組與對照組之間的差異顯著(P＜0．05)。

3 討論

ATRA是具有代表性的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，對細(xì)胞諸多方面有著很好的調(diào)節(jié)作用［5－6]，不過它的最低中毒劑量較低，容易產(chǎn)生中毒反應(yīng)，因此，越來越多的合成化學(xué)家希望能找到一種優(yōu)良的衍生物。本實驗研究新合成的衍生物——ATPR對腫瘤細(xì)胞株SH-SY5Y的影響，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度的ATPR對SH-SY5Y細(xì)胞具有不同程度的抑制作用，本實驗中選取的最大藥物濃度為10－4mol·L－1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、凋亡，推測此時藥物對細(xì)胞的抑制主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒作用，而在10－5mol·L－1時，誘導(dǎo)分化作用占主導(dǎo)形態(tài)的改變可以客觀的表明誘導(dǎo)分化劑的作用效果，是分化的典型標(biāo)志。吉姆薩染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的密集度有了顯著的降低，不斷有神經(jīng)突起形成，細(xì)胞向成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化，藥物的濃度越大，細(xì)胞形態(tài)的改變也就越大。

圖4 ATPR對SH-SY5Y維甲酸受體RARβ的影響

神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)在正常情況下常常分布在神經(jīng)元和周圍神經(jīng)組織中，甚至是在神經(jīng)內(nèi)分泌組織當(dāng)中也有存在［7]，一般細(xì)胞被破壞時釋放出來，是針對于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的一種高敏感和特異的指示物［8]。通過這次實驗，我們發(fā)現(xiàn)ATPR對SH-SY5Y細(xì)胞中的NSE有顯著的上調(diào)機(jī)制，而在所有的用藥濃度中，10－5mol·L－1的藥物濃度的作用最為明顯。

腫瘤細(xì)胞大部分存在于S期，而分化細(xì)胞主要存在于G0/G1期，因此細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期是細(xì)胞分化的重要特征，使用藥物后，處于G0/G1期的細(xì)胞越來越多，S期的細(xì)胞逐漸減少，周期明顯停滯在G0/G1期。

大量的研究表明，維甲酸的誘導(dǎo)分化與RARβ的影響有很大聯(lián)系，RARβ的低表達(dá)或者不表達(dá)對細(xì)胞的不良分化可能存在著相關(guān)因果［9－10]。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過維甲酸作用干涉后，RARβ含量逐漸增加，基本符合此前的研究報道［11]，同時我們也認(rèn)為維甲酸在SH-SY5Y中的作用可能是利用RARβ受體實現(xiàn)的，其有可能是研究分化機(jī)制的一類標(biāo)志物［12]。這次實驗細(xì)胞在維甲酸干涉后RARβ反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)一步表明RARβ在ATPR作用于SH-SY5Y時有密切關(guān)系。

由以上的分析可以看出，ATPR在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制SH-SY5Y增殖，上調(diào)RARβmRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)其向正常成熟細(xì)胞分化。隨著研究的深入，ATPR在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床應(yīng)用中將得到廣泛的使用，但其對神經(jīng)母細(xì)胞瘤誘導(dǎo)分化的機(jī)制是否與其它基因有關(guān)仍需進(jìn)一步探討。

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