葉 強(qiáng)，王 萌，張念章，殷 宏，2，張德林，2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省動物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

弓形蟲強(qiáng)免疫原性排泄分泌抗原組分的鑒定

葉 強(qiáng)1，王 萌1，張念章1，殷 宏1，2，張德林1，2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省動物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

旨在篩選弓形蟲排泄分泌抗原(ESA)中具有強(qiáng)抗原性的蛋白質(zhì)組分。通過雙向電泳和免疫印跡技術(shù)，對弓形蟲ESA進(jìn)行分析。結(jié)果共篩選到了18個(gè)免疫顯性蛋白質(zhì)點(diǎn)，并成功對其中6個(gè)具有代表性的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，顯示為微線體蛋白1、微線體蛋白4、包囊基質(zhì)蛋白和14-3-3蛋白，共4種。本研究進(jìn)一步為弓形蟲病的診斷和疫苗研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

弓形蟲；排泄分泌抗原；雙向電泳；免疫印跡；質(zhì)譜

剛地弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，能感染包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游?，并引發(fā)多種嚴(yán)重危害人和動物生命健康的疾病。據(jù)估計(jì)，全世界約有1/3的人感染，通常呈隱性感染[1]，孕婦感染弓形蟲會引起多種胎兒疾病[2-4]。近年來，艾滋病(AIDS)患者不斷增多，并發(fā)的弓形蟲腦炎成為AIDS患者死亡的主要原因之一。因此，弓形蟲的防治越來越受到關(guān)注，而研制高效的弓形蟲疫苗成為當(dāng)前最迫切的任務(wù)之一[5]。

目前已有的大部分疫苗，包括全蟲疫苗、排泄分泌抗原疫苗、核酸疫苗和基因工程疫苗等，但這些疫苗的效果并不是十分理想[5]，所以開發(fā)更加安全、有效的疫苗成為弓形蟲免疫預(yù)防的重要任務(wù)。弓形蟲排泄分泌抗原(excreted-secreted antigen，ESA)是蟲體在入侵宿主細(xì)胞及在細(xì)胞內(nèi)增殖和細(xì)胞外游離過程中向血液、組織間隙、體腔液或培養(yǎng)上清液釋放的可溶性抗原成分，主要包括微線體蛋白(microneme protein，MIC)、棒狀體蛋白(rhoptry protein，ROP)和致密顆粒蛋白(dense granule protein，GRA)等。大量研究顯示，弓形蟲ESA及其組分具有良好的反應(yīng)原性及免疫保護(hù)性，表明其具有開發(fā)新型診斷試劑及良好疫苗的潛力[6-7]。因此，深入研究ESA的蛋白成分、生化及免疫學(xué)特性，對了解弓形蟲的抗原特性、致病機(jī)制、免疫保護(hù)等均具有重要價(jià)值。

我們通過雙向電泳結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)，篩選與弓形蟲抗原性密切相關(guān)的一些蛋白質(zhì)，并通過質(zhì)譜成功進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步為弓形蟲的診斷和疫苗及新型藥物的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性昆明鼠，體重18～22 g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物實(shí)驗(yàn)中心。6月齡山羊，體重25～35 kg，購自甘肅省蘭州市榆中縣某羊場，經(jīng)弓形蟲間接血凝試劑盒檢測為弓形蟲抗體陰性。

1.2 蟲株

弓形蟲GJS強(qiáng)毒株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜寄生蟲病研究室保存。

1.3 細(xì)胞系

VERO細(xì)胞系由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜寄生蟲病研究室保存。

1.4 主要試劑

線性固相pH 梯度(immobilized pH gradient，IPG)干膠條(pH 4～7，24 cm)等購自美國Bio-Rad公司，PMSF、HRP標(biāo)記的抗羊二抗購自Sigma公司，PVDF膜購自美國Amersham公司，HRP-DAB底物顯色試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國GE公司，弓形蟲間接血凝檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.5 弓形蟲速殖子的收集

將液氮凍存的弓形蟲速殖子細(xì)胞懸液(濃度為2.0×106·mL-1)取出后，迅速置于37 ℃水中溶解，腹腔注射昆明小鼠，每只0.5 mL。待其發(fā)病后，腹腔沖洗收集新鮮的弓形蟲速殖子懸液，4 ℃ 100×g 離心10 min，除去腹水中的小鼠細(xì)胞和碎片，上清液再次4 ℃ 200×g 離心10 min，收集的沉淀即為弓形蟲速殖子。用PBS調(diào)整速殖子到合適的濃度后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與ESA收集

弓形蟲的培養(yǎng)和ESA的獲得參考T.A.Costa-Silva等[8]方法，ESA從感染弓形蟲的細(xì)胞培養(yǎng)基中獲得，方法如下：長勢良好的VERO細(xì)胞在接種弓形蟲之前，用PBS沖洗3次，加入新鮮的含1%胎牛血清的PRMI-1640，然后接種弓形蟲GJS株2.5×106個(gè)·mL-1，37 ℃共培養(yǎng)12 h后，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次。再加入新鮮不含血清成分的PRMI-1640，在37 ℃溫箱培養(yǎng)約48 h后，收集含有ESA的細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.22 μm的濾膜過濾后加入10 μg·mL-1的PMSF。樣品低溫凍干后，于-80 ℃保存。同時(shí)設(shè)未接種弓形蟲的細(xì)胞培養(yǎng)對照試驗(yàn)組，培養(yǎng)方式和過程以及培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)的收集與試驗(yàn)組完全相同。

1.7 蛋白質(zhì)樣品的制備

向凍干的蛋白質(zhì)粉末中加入適量的蛋白質(zhì)抽提液(8 mol·L-1Urea，2% CHAPS，0.2% Bio-Lyte ampholytes，50 mmol·L-1DTT，1% IPG buffer pH 4～7)使其充分溶解。4 ℃ 10 000×g 離心15 min，收集上清液，即為粗蛋白質(zhì)樣品。

采用TCA/丙酮沉淀法處理樣品：將粗蛋白質(zhì)樣品用5倍體積的預(yù)冷丙酮(含10% TCA和20 mmol·L-1DTT)-20 ℃沉淀2 h，4 ℃ 12 000×g 離心15 min，再用預(yù)冷丙酮(含20 mmol·L-1DTT)沖洗3次，自然揮干。加入適量上樣緩沖液，溶解蛋白質(zhì)。考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)樣品濃度后，分裝。直接用于雙向電泳或-80 ℃保存。

1.8 羊弓形蟲陰、陽性血清的制備

羊弓形蟲陰性血清：對體重為25～35 kg的山羊頸靜脈采血，1 000×g離心15 min，吸取血清，用弓形蟲間接血凝檢測試劑盒檢測其抗體滴度，確定該山羊?yàn)楣蜗x陰性后(抗體水平<1∶64)，保存血清，備用。

羊弓形蟲陽性血清：對體重為25～35 kg的山羊腹腔注射弓形蟲速殖子5 mL，濃度為2.0×106mL-1，10 d后，再次注射相同劑量的弓形蟲速殖子，如此重復(fù)5次后，頸靜脈采血，1 000×g離心15 min，吸取上層血清，用弓形蟲間接血凝檢測試劑盒檢測其抗體滴度，確定山羊弓形蟲陽性血清效價(jià)(抗體水平≥1∶64)，保存，備用。

1.9 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析

弓形蟲ESA 10 μg 經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用制備的羊弓形蟲陰、陽性血清為抗體，HRP標(biāo)記的抗羊二抗(1∶2 000)進(jìn)行Western blotting分析。用HRP-DAB底物顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.10 弓形蟲ESA二維電泳分析

弓形蟲ESA 4 ℃融化后，加入上樣緩沖液(8 mol·L-1尿素，2% CHAPS，0.2% IPG Buffer，50 mmol·L-1DTT，0.002%溴酚藍(lán))，混勻，4 ℃10 000×g離心10 min。按上樣量1 mg，總體積450 μL進(jìn)行上樣。采用50 V，20 ℃進(jìn)行主動水化12 h，然后直接進(jìn)行等電聚焦總電壓時(shí)間為110 kVh。等點(diǎn)聚焦結(jié)束后將膠條進(jìn)行兩步平衡。然后將平衡后的膠條移至12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠(24 cm×19 cm×0.1 cm)上進(jìn)行第二向電泳，二向電泳的程序：1.5 W·gel-145 min，15 W·gel-1直到溴酚藍(lán)跑到底，約4 h 30 min 。

選取2014年3月至2017年3月在本院接受治療的結(jié)腸癌患者103例，將患者隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組51例(完整結(jié)腸系膜切除術(shù))，對照組52例(傳統(tǒng)根治術(shù))。

1.11 凝膠染色和蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析

將上述兩塊凝膠中的一塊進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色過夜，然后脫色至蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰可見、背景顏色較淺為止，用UMAX PowerLook 1100透射掃描儀獲取圖像并保存。另一塊進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用制備的弓形蟲羊陰性、陽性血清為抗體，HRP標(biāo)記的抗羊二抗進(jìn)行Western blotting分析，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒將PVDF膜進(jìn)行膠片曝光顯影定影，流水沖洗后干燥并照相保存。

1.12 免疫反應(yīng)性蛋白的質(zhì)譜鑒定

將發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切取下來，用超純水漂洗兩次后，加入脫色液(25 mmol·L-1NH4HCO3、50%乙腈的水溶液)，脫色30 min。吸出脫色液，加入脫水液Ⅰ(50%的乙腈溶液)，脫水30 min，吸出脫水液Ⅰ，加入脫水液Ⅱ(100%的乙腈)，脫水30 min，吸出脫水液Ⅱ，加入20 μL酶解工作液(含0.02 μg·μL-1胰蛋白酶的酶解覆蓋液)，吸脹30 min，加入10 μL酶解覆蓋液(25 mmol·L-1NH4HCO3、10%乙腈的水溶液)，37 ℃水浴酶解過夜，酶解后上清轉(zhuǎn)移至另一新離心管中，加入50 μL蛋白質(zhì)萃取液于剩下的膠中，37 ℃溫浴30 min，5 000×g離心5 min，合并上清，凍干后待做質(zhì)譜。將干粉重新溶解于5 μL含0.1%TFA的溶液中，然后按照1∶1的比例與含50% ACN和含1% TFA的α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液混合，取1 μL樣品進(jìn)行質(zhì)譜點(diǎn)靶鑒定。

質(zhì)譜鑒定后，在數(shù)據(jù)庫T.gondii6.2中搜索，搜索參數(shù)如下：酶為胰蛋白酶；允許最大漏切位點(diǎn)為1；固定修飾為Carbamidomethyl(C)；可變修飾為Oxidation(M)；MS tolerance為0.005%；MS/MS tolerance為0.5 u；Protein score C.I.%大于95%為鑒定成功。

2 結(jié) 果

2.1 SDS-PAGE-WB

對收集到的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳免疫印跡試驗(yàn)(圖1)，弓形蟲ESA與羊弓形蟲陽性血清反應(yīng)結(jié)果中，共有8個(gè)陽性條帶(如圖1)，分別出現(xiàn)在約15、20、26、36、38、54、62和130 ku，其中在36 ku附近的陽性條帶信號最強(qiáng)，而ESA與羊弓形蟲陰性血清反應(yīng)沒有條帶出現(xiàn)(圖1)，對照組健康VERO細(xì)胞培養(yǎng)液中收集的蛋白質(zhì)與羊弓形蟲陽性血清作用，未出現(xiàn)陽性反應(yīng)條帶(圖1)。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.弓形蟲ESA蛋白與羊弓形蟲陽性血清反應(yīng)結(jié)果；2.VERO細(xì)胞培養(yǎng)上清液與羊弓形蟲陽性血清反應(yīng)結(jié)果；3.弓形蟲ESA蛋白與羊弓形蟲陰性血清反應(yīng)結(jié)果M.Protein molecular weight marker；1.The reaction of the T.gondii excreted-secreted antigen and positive serum of T.gondii in goat；2.The reaction of the cell supernatant of VERO and positive serum of T.gondii in goat；3.The reaction of the T.gondii ESA and negative serum of T.gondii in goat圖1 免疫血清與抗原免疫印跡反應(yīng)Fig.1 Reactivity of anti-Toxoplasma gondii sera with antigens in Western blotting

2.2 弓形蟲ESA的雙向電泳圖譜

2.3 2-DE-WB和質(zhì)譜分析

f托氟沙星納米乳的制備及其急性毒性研究結(jié)果顯示共檢測到了18個(gè)陽性蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖3)。選擇了其中的6個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，并成功對這6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示它們屬于4種特定蛋白質(zhì)，包括微線體蛋白1(microneme protein 1，MIC1)、 微線體蛋白4(microneme protein 4，MIC4)、包囊基質(zhì)蛋白(cyst matrix protein)、14-3-3蛋白(14-3-3 protein)(表1)。

圖2 弓形蟲雙向電泳圖譜Fig.2 2-DE image of Toxoplasma gondii-infected excreted-secreted antigen

圖3 弓形蟲ESA免疫印跡得到的陽性蛋白質(zhì)點(diǎn)Fig.3 Positive protein spots of Toxoplasma gondii excreted-secreted antigen identified by the Western blotting

表1 質(zhì)譜鑒定的陽性蛋白質(zhì)點(diǎn)

Table 1 Protein from excreted-secreted antigen ofToxoplasmagondiiidentified by mass spectrometry

位點(diǎn)號SpotNo．蛋白質(zhì)登錄號AccessionNo．蛋白質(zhì)名稱Proteinname分值Proteinscore蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量ProteinMW等電點(diǎn)PI覆蓋度Coverage1gi|211967270|micronemeprotein4，MIC4123651475．06172gi|211963364|cystmatrixprotein，putative234494644．89193gi|211963364|cystmatrixprotein，putative255494644．89234gi|211966195|micronemeprotein1，MIC1110496255．15205gi|237832223|14?3?3protein，putative75373795．05136gi|237832223|14?3?3protein，putative81373795．0527

3 討 論

弓形蟲ESA在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)存活過程中，都起到關(guān)鍵作用，組分較為復(fù)雜。ESA具有良好的反應(yīng)原性及免疫保護(hù)性，多種弓形蟲免疫效果良好的蛋白質(zhì)，如GRA6[9]蛋白等，都是其重要的組成成分。本文利用從感染弓形蟲的VERO細(xì)胞培養(yǎng)基上清收集的弓形蟲ESA進(jìn)行免疫反應(yīng)原性檢測，以篩選具有免疫原性的弓形蟲排泄分泌抗原。SDS-PAGE-WB結(jié)果共檢測到了8個(gè)陽性條帶，與已報(bào)道的相關(guān)研究結(jié)果相一致[10-11]，并且對照組試驗(yàn)中沒有出現(xiàn)陽性反應(yīng)條帶。其中36 ku附近的陽性條帶信號最強(qiáng)，表明該蛋白質(zhì)條帶具有較好的反應(yīng)原性。根據(jù)已有的研究顯示多種蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量在36 ku附近，例如MIC6、MIC7、GRA4以及GRA10等。20 ku的條帶可能與MIC5、GRA1和GRA2密切相關(guān)，26 ku的蛋白質(zhì)條帶則與GRA7的相對分子質(zhì)量一致，另外MIC3和ROP9的相對分子質(zhì)量大小也正好與38 ku的條帶匹配，而ROP2蛋白家族的多個(gè)成員的相對分子質(zhì)量大小則分布于54和62 ku，正好與本文的結(jié)果相一致[1，10，12-15]。

通過雙向電泳考馬斯亮藍(lán)染色圖譜共檢測到超過1 000個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，其等電點(diǎn)主要分布于4.0～7.0，并結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)共檢測到了18個(gè)具有免疫原性的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中一些蛋白質(zhì)點(diǎn)緊密靠在一起，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷極有可能是同一蛋白質(zhì)的不同修飾類型所造成，所以對于這類蛋白質(zhì)選取其中具有代表性的6個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索，并成功對其進(jìn)行了鑒定，它們歸屬于4種特定蛋白質(zhì)，包括MIC1、MIC4、包囊基質(zhì)蛋白(cyst matrix protein)和14-3-3蛋白(14-3-3 protein)。

MIC1和MIC4是由位于弓形蟲蟲體前端的分泌器官——微線體分泌的蛋白質(zhì)，是一種重要的宿主結(jié)合蛋白，與蟲體識別和結(jié)合宿主密切相關(guān)，它們常與MIC6結(jié)合形成復(fù)合體而發(fā)揮作用，且這種復(fù)合體對分泌運(yùn)輸過程起著至關(guān)重要的作用[12，16-17]。本研究中MIC1和MIC4均被羊抗弓形蟲血清檢測到，表明其具有良好反應(yīng)原性。對MIC1和MIC4已有的研究顯示，它們具有良好的免疫保護(hù)性，用其研制的疫苗免疫小鼠能夠引起顯著的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并延長小鼠的存活時(shí)間[18-19]。

包囊基質(zhì)蛋白又叫基質(zhì)抗原1(matrix antigen 1，MAG1)，表達(dá)于寄生蟲組織包囊、包囊基質(zhì)和包囊壁，在弓形蟲速殖子和緩殖子階段均有表達(dá)，但在后者具有更高的表達(dá)[20]。M.Di Cristina等[21]的研究顯示MAG1能夠引起特異性的B、T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，免疫保護(hù)試驗(yàn)也證實(shí)其具有一定的免疫保護(hù)性[22]，同時(shí)也在弓形蟲的診斷上顯示出巨大的潛力。目前對MAG1的研究還非常有限，可能具有介導(dǎo)黏附和侵入宿主細(xì)胞的作用[21]，還需要進(jìn)一步的研究。

14-3-3蛋白廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，并且具有高度的保守性，參與多種重要細(xì)胞生理過程，主要包括細(xì)胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期的調(diào)控和細(xì)胞凋亡等，對真核生物具有重要意義[23-24]。目前，已經(jīng)對包括弓形蟲在內(nèi)的多種寄生蟲的14-3-3蛋白進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示由其制備的多種疫苗均具有一定的免疫保護(hù)作用，而由14-3-3蛋白作為抗原進(jìn)行ELISA檢測，顯示出高度的敏感性和特異性，表明14-3-3蛋白是良好的疫苗和診斷試劑候選分子。本研究中6號斑點(diǎn)14-3-3蛋白信號非常強(qiáng)，表明其具有良好的反應(yīng)原性。

4 結(jié) 論

應(yīng)用雙向電泳和免疫印跡技術(shù)，對弓形蟲具有強(qiáng)免疫原性的排泄分泌抗原中具有的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行了篩選，分析發(fā)現(xiàn)，篩選到18個(gè)免疫顯性蛋白質(zhì)點(diǎn)，并對其中6個(gè)具有代表性的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，顯示為微線體蛋白1、 微線體蛋白4、包囊基質(zhì)蛋白和14-3-3蛋白。

[1] DUBEY J P.Toxoplasmosis of animals and humans[M].Secondth edition，Boca Raton，NewYork：CRC Press Inc，2010：1-313.

[2] COOK G C.Toxoplasmagondiiinfection a potential danger to the unborn fetus and AIDS sufferer[J].QJMed，1990，74(273)：3-19.

[3] DODDS E M.Toxoplasmosis[J].CurrOpinOphthalmol，2006，17(6)：557-561.

[4] MONTOYA J G，LIESENFELD O.Toxoplasmosis[J].Lancet，2004，363(9425)：1965-1976.

[5] ZHANG N Z，CHEN J，WANG M，et al.Vaccines againstToxoplasmagondii：new developments and perspectives[J].ExpertRevVaccines，2013，12(11)：1287-1299.

[6] 李潤花，孟曉麗，殷國榮，等．霍亂毒素佐劑聯(lián)合弓形蟲ESA鼻內(nèi)免疫小鼠抗弓形蟲感染作用[J]．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010，10(10)：1184-1186． LI R H，MENG X L，YIN G R，et al.Intranasal immunization with CT adjuvant and ESA proteces mice againstToxoplasmagondiiinfection[J].JournalofTropicalMedicine，2010，10(10)：1184-1186.(in Chinese)

[7] 白 昀，王海燕，王占偉，等．豬弓形蟲重組MIC3蛋白單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用[J]．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(10)：1622-1628． BAI Y，WANG H Y，WANG Z W，et al.Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies against rMIC3 ofToxoplasmagondii[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(10)：1622-1628.(in Chinese)

[8] COSTA-SILVA T A，MEIRA C S，F(xiàn)ERREIRA I M，et al.Evaluation of immunization with tachyzoite excreted-secreted proteins in a novel susceptible mouse model(A/Sn) forToxoplasmagondii[J].ExpParasitol，2008，120(3)：227-234.

[9] BLANCHARD N，GONZALEZ F，SCHAEFFER M，et al.Immunodominant，protective response to the parasiteToxoplasmagondiirequires antigen processing in the endoplasmic reticulum[J].NatImmunol，2008，9(8)：937-944.

[10] AHN M H，SON H J，LEEM M H，et al.Antigen analysis ofToxoplasmagondiilysate and excretory-secretory materials by enzyme-linked immunoelectrotransfer blot(EITB)[J].KoreanJParasitol，1994，32(4)：249-257.

[11] DARYANI A，SHARIF M，KALANI H，et al.Electrophoretic patterns ofToxoplasmagondiiexcreted/secreted antigens and their role in induction of the humoral immune response[J].JundishapurJMicrobiol，2014，7(4)：e9525.

[12] REISS M，VIEBIG N，BRECHT S，et al.Identification and characterization of an escorter for two secretory adhesins inToxoplasmagondii[J].JCellBiol， 2001，152(3)：563-578.

[13] MEISSNER M，REISS M，VIEBIG N，et al.A family of transmembrane microneme proteins ofToxoplasmagondiicontain EGF-like domains and function as escorters[J].JCellSci，2002，115(Pt 3)：563-574.

[14] AHN H J，KIM S，NAM H W.Host cell binding of GRA10，a novel，constitutively secreted dense granular protein fromToxoplasmagondii[J].BiochemBiophysResCommun，2005，331(2)：614-620.

[15] BRADLEY P J，WARD C，CHENG S J，et al.Proteomic analysis of rhoptry organelles reveals many novel constituents for host-parasite interactions inToxoplasmagondii[J].JBiolChem，2005，280(40)：34245-34258.

[16] SAOUROS S，EDWARDS-JONES B，REISS M，et al.A novel galectin-like domain fromToxoplasmagondiimicronemal protein 1 assists the folding，assembly and transport of a cell adhesion complex[J].JBiolChem，2005，280(46)：38583-38591.

[17] FRIEDRICH N，SANTOS J M，LIU Y，et al.Members of a nove1 protein family containing microneme adhesive repeat domains act as sialic acid-binding lectins during host cell invasion by apicomplexan parasites[J].JBiolChem，2010，285(3)：2064-2076.

[18] LOUREN?O E V，BERNARDES E S，SILVA N M，et al.Immunization with MIC1 and MIC4 induces protective immunity againstToxoplasmagondii[J].MicrobesInfect，2006，8(5)：1244-1251.

[19] PENG G H，YUAN Z G，ZHOU X H，et al.Sequence variation inToxoplasmagondiiMIC4 gene and protective effect of an MIC4 DNA vaccine in a murine model against toxoplasmosis[J].JAnimVetAdv，2010，9(10)：1463-1468.

[20] FERGUSON D J，PARMLEY S F，TOMAVO S，et al.Evidence for nuclear localisation of two stage-specific isoenzymes of enolase inToxoplasmagondiicorrelates with active parasite replication[J].IntJParasitol，2002，32(11)：1399-1410.

[21] DI CRISTINA M，DEL PORTO P，BUFFOLANO W，et al.TheToxoplasmagondiibradyzoite antigens BAG1 and MAG1 induce early humoral and cell-mediated immune responses upon human infection[J].MicrobesInfect，2004，6(2)：164-171.

[22] PARMLEY S，SLIFER T，ARAUJO F.Protective effects of immunization with a recombinant cyst antigen in mouse models of infection withToxoplasmagondiitissue cysts[J].JInfectDis，2002，185(suppl 1)：90-95.

[23] FU H，COBURN J，COLLIER R J.The eukaryotic host factor that activates exoenzyme S ofPseudomonasaeruginosais a member of the 14-3-3 protein family[J].ProcNatlAcadSciUSA，1993，90(6)：2320-2324.

[24] ZHA J，HARADA H，YANG E，et al.Serine phosphorylation of death agonist BAD in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not BCL-X(L)[J].Cell，1996，87(4)：619-628.

(編輯 白永平)

Identification of High Immunogenic Components ofToxoplasmagondiiExcreted-secreted Antigens

YE Qiang1，WANG Meng1，ZHANG Nian-zhang1，YIN Hong1，2，ZHANG De-lin1，2*

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology，KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince，LanzhouVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730046，China；2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandCentralofImportantAnimalInfectiousDisease，Yangzhou225009，China)

The objective of this study was to screen the main immunogenic antigen ofToxoplasmagondiiexcreted-secreted antigen(ESA).2-DE combined with Western blotting were used to analysis the components ofT.gondiiESA.Eighteen positive protein points were detected in this study.Among them，6 protein spots were selected to identify by matrix-assisted laser desorption/lionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF)，belonging to microneme protein 1，microneme protein 4，cyst matrix protein and 14-3-3 protein.This study provides a new reference for looking for new candidate molecules for prevention and diagnosis of toxoplasmosis.

Toxoplasmagondii；ESA；2-DE；Western blotting；mass spectrometry

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.020

2015-02-12

甘肅省創(chuàng)新研究團(tuán)體計(jì)劃項(xiàng)目(1210RJA006)；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(NBCIS CARS-38)

葉 強(qiáng)(1986-)，男，四川綿陽人，碩士，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)研究，E-mail：yeqiang251@163.com

*通信作者：張德林，E-mail：zhangdl2005@163.com

S852.729

A

0366-6964(2015)11-2063-06