孫玉章，何 彪，許運(yùn)斌，叢彥龍，Karl－Klaus Conzelmann

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122；3.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310020；4.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062；5.慕尼黑大學(xué)基因中心，慕尼黑81377）

狂犬?。╮abies）是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的以侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的急性人獸共患傳染病，病死率幾乎高達(dá)100%。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)道全球每年有約55000人死于狂犬病，其中絕大多數(shù)發(fā)生在亞洲、非洲等發(fā)展中國(guó)家［1］?？袢〔《臼菑棤畈《究疲≧habdoviridae）狂犬病病毒屬（Lyssavirus）成員，其基因組為不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。RABV基因組編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，依次為核蛋白（nucleoprotein，N）、磷酸化蛋白 （phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）、糖蛋白（glycoprotein，G）和RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp／L）［2］。目前，學(xué)術(shù)界一般將狂犬病病毒屬劃分為7個(gè)基因型，其中6個(gè)基因型的RABV均以蝙蝠為宿主和媒介生物（基因III型，即MOKV的確切宿主尚未確定），另外還有一些新近分離出的RABV毒株尚待分型［3］。

狂犬病病毒基因組RNA只有與核蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein，RNP）才能在磷蛋白的催化下被RNA依賴的RNA聚合酶蛋白識(shí)別并作為轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板［4］。因此，經(jīng)典的RABV的反向遺傳操作系統(tǒng)除了構(gòu)建具有精確末端序列的全長(zhǎng)基因組cDNA克隆外，還需要構(gòu)建表達(dá)核蛋白、磷蛋白和聚合酶大蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)募?xì)胞系才可能獲得具有感染性的病毒顆粒［5］。

本研究在已建立SAD L16株高效拯救的反向遺傳操作平臺(tái)基礎(chǔ)上［6］，以SAD L16株全長(zhǎng)基因組cDNA克隆為骨架，利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）分別構(gòu)建了5個(gè)全長(zhǎng)cDNA克隆［7］并直接轉(zhuǎn)染BSR T7／5細(xì)胞系，獲得了2株重組病毒。通過(guò)進(jìn)一步鑒定和分析重組狂犬病病毒株的生物學(xué)特性，本研究首次建立起RABV的單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，并以此為平臺(tái)開展了一系列研究。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

BSR T7／5細(xì)胞系由本室保存，以含10%胎牛血清的GMEM培養(yǎng)?？袢〔《維AD L16株由本室保存，其全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pSAD－L16由本室構(gòu)建并保存。分別克隆有腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）IRES 序列、脊髓灰質(zhì)炎病毒（polivirus，PV）IRES序列和明脈扁刺蛾病毒（Thosea asigna virus，TaV）2A序列的pRLCMV載體質(zhì)粒均由本室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑

Phusion DNA聚合酶購(gòu)自Finnzymes公司，反轉(zhuǎn)錄聚合酶購(gòu)自Roche公司，T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，質(zhì)?？焖俪樘嵩噭┖泻湍z快速回收試劑盒均購(gòu)自QIAGEN公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司，CaPO4轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Stratagene公司，其他限制性內(nèi)切酶主要購(gòu)自NEB或Fermentas公司，細(xì)胞培養(yǎng)血清及相關(guān)試劑均購(gòu)自Invitrogen公司，其他試劑或化學(xué)藥品均購(gòu)自Invitrogen、Roche或Sigma公司。

1.3 重組全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建

根據(jù)全長(zhǎng)cDNA感染性克隆pSAD－L16 N、P和L基因上游序列的不同分別設(shè)計(jì)多對(duì)引物擴(kuò)增EMCVIRES 序列（e）、PVIRES 序列（p）和 TaV 2A序列（t），將其分別克隆入pSAD－L16載體的對(duì)應(yīng)位置中，構(gòu)建成5個(gè)全長(zhǎng)cDNA克隆:pSAD－eNePeL（Ⅰ）、pSAD－eNtPeL（Ⅱ）、pSAD－NeNePeL（Ⅲ ）、pSAD－NeNpPeL （Ⅳ ）和 pSAD－NeNtPeL（Ⅴ）。所有構(gòu)建的cDNA克隆經(jīng)測(cè)序正確后大量制備并純化。5個(gè)全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建策略如圖1所示。

圖1 重組全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建模式Fig.1 Construction of 5full－length cDNA clones based on pSAD－L16

1.4 重組病毒的拯救

轉(zhuǎn)染前16h將BSR T7／5細(xì)胞分鋪到6孔板，用含10%胎牛血清的GMEM培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1h更換為不含血清的GMEM培養(yǎng)。CaPO4法分別轉(zhuǎn)染10μg全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒至每孔細(xì)胞中，輕晃混勻。同時(shí)設(shè)單質(zhì)粒組（分別單獨(dú)輔助轉(zhuǎn)染pTiT－N、pTiT－P或pTiT－L質(zhì)粒）和常規(guī)組（同時(shí)轉(zhuǎn)染pTiTN、pTiT－P和pTiT－L 3個(gè)輔助質(zhì)粒）4個(gè)對(duì)照組。37℃培養(yǎng)6h，PBS清洗3次后更換含10%胎牛血清的GMEM繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后每3d取培養(yǎng)液感染新的BSR T7／5細(xì)胞并以FITC標(biāo)記的鼠抗狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，直到第12天。獲救的每一代次的重組狂犬病病毒首先進(jìn)行RTPCR并測(cè)序，序列完全正確的病毒測(cè)定滴度后以MOI＝0.01接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每72h收獲一次培養(yǎng)液，連續(xù)收獲3次，并儲(chǔ)存于－80℃超低溫冰箱。

1.5 重組狂犬病病毒生物學(xué)特性的鑒定

重組狂犬病病毒的滴度測(cè)定:將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清液以不含胎牛血清的GMEM連續(xù)做10倍梯度稀釋后取100μL接種于96孔板中的單層BSR T7／5細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)48h，棄細(xì)胞上清液，PBS清洗后用80%丙酮冷藏固定20min，洗棄冷丙酮后以FITC標(biāo)記的鼠抗狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體37℃染色2h，PBS清洗3次后置于熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒終釋滴度。

生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定:拯救重組病毒以MOI＝0.01接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，6h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液并更換新鮮GMEM培養(yǎng)液，每24h收獲一次，直到96h。收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液梯度稀釋后接種于96孔板，37℃培養(yǎng)48h后以FITC標(biāo)記的鼠抗狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算終釋病毒滴度并繪制多步生長(zhǎng)曲線。

重組狂犬病病毒的遺傳穩(wěn)定性:拯救重組病毒以MOI＝1接種于BSR T7／5細(xì)胞，每96～120h收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)移到新BSR T7／5細(xì)胞中繼續(xù)傳代和轉(zhuǎn)染96孔板測(cè)定病毒滴度，連續(xù)傳代20次，每5代收集一次細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行RT－PCR并測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 重組狂犬病病毒的拯救

在完全不依靠轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒的情況下，只有pSAD－NeNePeL（Ⅲ）和pSAD－NeNtPeL（Ⅴ）能夠成功拯救出重組狂犬病病毒，pSAD－NeNePeL直接轉(zhuǎn)染成功率較高（12／12），pSAD－NeNtPeL 成功率較低（8／14），單獨(dú)轉(zhuǎn)染任何一種輔助質(zhì)粒pTiT－N、pTiT－P或pTiT－L對(duì)拯救效率均無(wú)顯著影響，轉(zhuǎn)染后第6天均可在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到病毒顆粒（圖2）。

圖2 重組狂犬病病毒的DFA檢測(cè)Fig.2 Identification of recombinant RABVs with FITC－antiN－Mab

2.2 重組狂犬病病毒的增殖動(dòng)態(tài)

初代獲救的重組狂犬病病毒的多步生長(zhǎng)曲線如圖3所示，重組狂犬病病毒SAD－NeNePeL和SADNeNtPeL均高度致弱且增殖緩慢。

圖3 重組狂犬病病毒多步生長(zhǎng)曲線Fig.3 Multistep growth curves of recombinant RABVs

SAD－NeNePeL和 SAD－NeNtPeL 2株重組狂犬病病毒在終釋滴度均能形成與野生型親本毒株SAD－L16株大小形態(tài)不同的熒光灶（圖4）。

圖4 重組狂犬病病毒的熒光灶形態(tài)Fig.4 Different phenotypes in foci size of recombinant RABVs

2.3 重組狂犬病病毒的遺傳穩(wěn)定性

重組狂犬病病毒SAD－NeNePeL在BSR T7／5細(xì)胞中僅能傳3～5代，RT－PCR結(jié)果顯示在第3代的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中就已經(jīng)存在不同水平的重組株，且表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。重組狂犬病病毒SAD－NeNtPeL在BSR T7／5細(xì)胞中則能穩(wěn)定傳代20次，且RT－PCR結(jié)果顯示序列高度穩(wěn)定。

3 討 論

經(jīng)典狂犬病病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立除需精確構(gòu)建病毒基因組的全長(zhǎng)cDNA克隆外，還需提供分別表達(dá)N、P和L 3種蛋白質(zhì)的輔助質(zhì)粒，才可能形成RNP復(fù)合物并起始病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯。順式作用元件IRES序列的發(fā)現(xiàn)［8－9］給我們的研究提供了另外一種可能:通過(guò)在狂犬病病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆中N、P和L基因上游克隆入相應(yīng)序列以實(shí)現(xiàn)單一質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)多種mRNA。因此，我們分別設(shè)計(jì)了包含EMCVIRES序列、PVIRES序列或TaV 2A序列的多個(gè)全長(zhǎng)cDNA克隆，并先后建立起了三質(zhì)粒拯救系統(tǒng)和二質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，最終有2個(gè)單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)成功拯救出重組狂犬病病毒株。

單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)在負(fù)鏈分節(jié)段的流感病毒已有報(bào)道［10］，但其采用的方法并不適用于負(fù)鏈不分節(jié)段的狂犬病病毒。通過(guò)引入順式作用元件IRES序列建立的單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)獲救的SAD－NeNePeL株具有較高的拯救成功率，但基因組間的重配概率較高，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中至少存在3種基因重組株且呈現(xiàn)不同的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性；而SAD－NeNtPeL則可以穩(wěn)定的表達(dá)多順?lè)醋觤RNA且具有相當(dāng)?shù)倪z傳穩(wěn)定性。值得注意的是在N基因上游引入IRES序列構(gòu)建的多個(gè)全長(zhǎng)cDNA克隆無(wú)一拯救成功，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致拯救失敗的原因是在N基因氨基端存在一個(gè)此前未曾報(bào)道過(guò)的順式調(diào)控元件（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此本研究通過(guò)引入表達(dá)更高效的EMCVIRES序列串聯(lián)起2個(gè)N基因，最終無(wú)需提供輔助質(zhì)粒pTiT－N即可拯救出重組狂犬病病毒。

利用建立的狂犬病病毒單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，本室先后開展了基于Pol－II聚合酶拯救系統(tǒng)的建立以及更高效的二質(zhì)粒拯救系統(tǒng)的建立等研究。這些反向遺傳操作系統(tǒng)的建立為深入研究狂犬病病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能、狂犬病病毒分子致病機(jī)制、狂犬病病毒與宿主相互作用以及新型嗜神經(jīng)性病毒載體和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等提供了一個(gè)有力的研究工具和基礎(chǔ)的技術(shù)平臺(tái)。

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