楊 琨，張 倩，李谷月，潘陽陽，余四九，何俊峰，崔 燕

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

溫和冷應激及復溫對牦牛卵巢顆粒細胞的影響

楊 琨，張 倩，李谷月，潘陽陽，余四九，何俊峰，崔 燕*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

細胞冷應激反應是一個復雜的過程，它包括低溫本身的應激階段和復溫后的應激階段。本研究以牦牛卵巢顆粒細胞為研究對象，利用實時熒光定量PCR、Western blot技術，分析溫和冷處理1、5 d及復溫1、2、4、8及24 h條件下，細胞內(nèi)CIRBP、HSP70及P53變化規(guī)律。結果顯示，細胞在25 ℃培養(yǎng)5 d，然后通過復溫至37 ℃，會影響細胞生理狀態(tài)以及誘導細胞應激反應。CIRBP的表達量在25 ℃溫和冷處理第1天開始上升，并且在復溫后24 h左右恢復到正常水平。HSP70的表達量在37 ℃復溫培養(yǎng)后逐步上升，復溫8 h出現(xiàn)峰值，隨后下降。P53 mRNA表達水平在復溫培養(yǎng)4 h出現(xiàn)峰值，隨后下降，并且其在CIRBP及HSP70 mRNA高表達時，均有明顯的下降。結果表明，低溫會誘導細胞CIRBPmRNA和蛋白表達水平的上升；HSP70能夠被冷應激后的復溫誘導；CIRBP和HSP70都具有抗應激損害和細胞凋亡的作用。這些數(shù)據(jù)將為亞低溫和復溫在各種研究和治療領域的應用提供參考。

牦牛；卵巢顆粒細胞；溫和冷應激；復溫；CIRBP；HSP70；P53

細胞應激反應普遍存在于生物界，熱、冷、缺氧、低滲等應激因素均可打破細胞代謝的相對平衡，并引發(fā)細胞內(nèi)一系列復雜的基因表達和生理適應性反應過程。目前，人們已對熱休克效應進行了深入研究，而冷應激方面的研究資料相對較少。另外，正常生理或意外情況下，恒溫動物或培養(yǎng)條件下的細胞、組織和器官都有可能受到各種溫度冷應激及復溫的影響，例如心臟手術或腦損傷治療過程中常需降低體溫，器官和細胞的保存運輸通常也在低溫下進行，以及提升重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量也是通過降低溫度得到實現(xiàn)[1-4]。冷應激后復溫至正常溫度，觀察到的過高熱表型變化，表明細胞正在以某種方式使其自身適應溫和溫度，并感應相對而不是絕對的低溫[5]。溫和冷應激(25～35 ℃)和熱休克都是以某種方式誘導相似的表型修飾，有研究報道，雖然一些對溫度變化較敏感的蛋白質(zhì)表達量不變或增加，但其轉(zhuǎn)錄和翻譯速率會普遍下降[6-7]。另外，冷應激還會影響mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)、替代轉(zhuǎn)錄起始位點和影響最終剪接[8]。還有資料顯示，溫和冷應激也能夠引起代謝下降[9-10]、細胞周期停滯[11]、凋亡程序活化、細胞骨架分解等[4，10-12]。

在眾多的冷休克蛋白(Cold shock protein,CSP)中，冷誘導RNA結合蛋白(Cold inducible RNA binding protein,CIRBP)受到廣泛關注。CIRBPmRNA表達是通過控制啟動子的冷應激元件進行轉(zhuǎn)錄[4]。在亞低溫其表達顯著增加，這似乎是適應冷應激的關鍵決定因素，并且能通過各種機制誘導冷特異性因子轉(zhuǎn)錄、翻譯[7，10，13]，另外，研究發(fā)現(xiàn)CIRBP基因具有抗應激損害和細胞凋亡的作用。熱應激蛋白(Heat stress proteins，HSPs)是由細胞核內(nèi)高度保守的熱應激基因編碼的蛋白，普遍存在于整個生物界，幾乎所有的細胞均能合成HSPs。HSP充當?shù)鞍踪|(zhì)的分子伴侶，參與許多細胞的正常生理過程，直接參與蛋白質(zhì)從初生鏈合成到多亞基復合體折疊、裝配的整個生物合成，并參與蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的移位、參與分解錯裝的蛋白質(zhì)等，并與新生肽和多肽鏈中錯配的部分結合，對調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。另外，研究表明HSPs還可調(diào)節(jié)細胞的氧化還原狀態(tài)[14]，并在一些促凋亡效應發(fā)生時，能夠防止細胞凋亡。另外，HSPs能夠被熱應激或冷應激后的復溫誘導[15]。HSP70是一族最保守和最重要的熱休克蛋白，其在正常細胞內(nèi)表達水平較低，而在應激狀態(tài)下顯著升高，可作為應激反應和評價組織細胞處于危險狀態(tài)的分子生物標志，因此已成為HSPs中關注的焦點。P53腫瘤抑制蛋白是含有P53、P63以及P73的P53蛋白超家族內(nèi)一名成員。P53蛋白在細胞凋亡過程中發(fā)揮至關重要的作用，能夠?qū)碜约毎麘し磻母鞣N信息，如DNA損傷、缺氧、核苷酸缺失等信號傳遞給相關基因，誘導細胞周期停滯和細胞凋亡[16-17]。

牦牛常年生活在低溫、低氧和高海拔的青藏高原，其繁殖效率受到嚴重影響，本課題組主要從事牦牛胚胎移植的研究。通常將器官、細胞從高原運輸?shù)綄嶒炇矣休^長時間的延遲，在此期間，細胞通常保持在22～25 ℃，為其提供一個“睡眠模式”，避免在運輸過程中受到各種干擾[18]，其后，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在前期試驗中，發(fā)現(xiàn)細胞在25 ℃處理5 d，37 ℃復溫后，形態(tài)發(fā)生變化。因此，將進一步對25 ℃細胞儲存期間及37 ℃復溫后，CIRBP、HSP70以及P53 mRNA及蛋白的表達變化及相關性進行研究。這些數(shù)據(jù)帶來的一些新的細胞和分子機制，可能對組織和器官的低溫儲存提供參考，并為研究生理低溫、治療低溫或意外低溫后復溫的適應性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

青海省西寧市樂家灣屠宰場3歲左右的健康母牦牛。

1.2 主要試劑

胎牛血清、Trizol購自美國Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、限制性內(nèi)切酶、pMD18-T vector、熒光定量試劑盒均為大連寶生物公司產(chǎn)品。DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、DEPC、Tris堿、四甲基聯(lián)苯胺和TEMED購自Sigma公司。丙烯酰胺和N，N′-亞甲雙丙烯酰胺購自Amresco公司。蛋白分子質(zhì)量標準marker和預染蛋白質(zhì)marker購自Fermentas公司。SDS購于合肥博美生物科技有限責任公司，濾紙購自美國伯樂公司。PVDF膜購自Millipor公司，蛋白裂解液購自Solarbio公司，ECL曝光液購自碧云天公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、免疫組化SP試劑盒、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京天根有限公司。山羊源CIRBP多克隆抗體(ab106230)及兔源HSP70多克隆抗體(ab79852)購自英國Abcam，鼠源內(nèi)參Actin抗體(I-19)購自Santa Cruz公司，兔源FSHR多克隆抗體(bs-0895R)、兔抗羊(bs-0295G-HRP)、羊抗兔(bs-0294R-HRP)、羊抗鼠(bs-0296G-HRP)購自北京博奧森公司。引物由TaKaRa公司合成，測序由華大基因公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵巢顆粒細胞的培養(yǎng) 按照F.Caloni等[19]方法，并適當調(diào)整進行常規(guī)卵巢顆粒細胞培養(yǎng)試驗。待細胞匯合率達90%以上傳代，同時冷凍保存。將傳至3～5 代的細胞用于試驗(圖1A)。

冷處理和復溫試驗中，細胞進行胰蛋白酶消化并以10 000個·cm-2接種并在37 ℃下培養(yǎng)。在凍存細胞前，收集部分細胞樣品作為對照組(0 d)，并提取RNA或蛋白質(zhì)。對于溫和低溫試驗，細胞在相同培養(yǎng)基25 ℃下處理1～5 d，然后轉(zhuǎn)至37 ℃下進行1～24 h復溫。

1.3.2FSHR免疫細胞化學染色 采用免疫細胞化學技術測定促卵泡刺激素受體(FSHR) 在顆粒細胞的特異性表達，具體步驟參照文獻[20-21]。1.3.3 引物設計與合成 牦牛P53基因測序引物(yakP53-1、P53-2)根據(jù)GenBank中家牛(NM174201)、瘤牛(U74486)、綿羊(NM001009403)、野豬(AF124298)的P53基因序列設計得到；根據(jù)牦牛CIRBP(KF682140)、HSP70(KC790105)、β-actin(DQ838049)及提交的P53(KF682141)基因序列設計熒光定量引物，由TaKaRa公司合成(表1)。序列分析使用NCBI在線軟件、MEGA5和DNAman軟件。

表1 PCR擴增引物和熒光定量PCR引物

Table 1 PCR primers used in the RT-PCR and real-time RT-PCR

引物名稱Primersname引物序列(5'-3')Primerscomposition產(chǎn)物大小/bpPCRproductssize/bpYakP53senseprimer-1CGACCTCGGAGCGTGCAT1390YakP53antisenseprimer-1GCCACAGGCTGAGCAGATGAYakP53senseprimer-2GGTGCTTAGACCTCTGCTTGG707YakP53antisenseprimer-2GGTGACATGGTGTGCCTTGCYakCIRBPreal-timeSGTATGCCGTTTTCTTTGGCTTC126YakCIRBPreal-timeASGCTCTACTCTGCCTGCCTCAAYakHSP70real-timeSACCTTCGACGTGTCCATCCT145YakHSP70real-timeASCCTTCTTGTGCTTGCGTTTGYakP53real-timeSCCCATCCTCACCATCATCAC80YakP53real-timeASGCACAAACACGCACCTCAAYakβ-actinreal-timeSAGGCTGTGCTGTCCCTGTATG207Yakβ-bactinreal-timeASGCTCGGCTGTGGTGGTAAA

1.3.4 mRNA的提取，反轉(zhuǎn)錄cDNA及PCR擴增 收集顆粒細胞，用TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PRC反應體系為20 μL(模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq PCR Master Mix 10 μL，無菌去離子水8 μL) 。取10 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，150 V 20 min。紫外燈下觀察并用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物片段，華大基因公司測序。

1.3.5 熒光定量PCR 使用羅氏480儀器進行試驗。反應體系：10 μL SYBR Premax Tag、 0.5 μL 上、下游引物、1 μL cDNA 樣品和8 μL 滅菌超純水。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共45個循環(huán)。擴增結束后進行熔解曲線分析。每管樣品設4個重復，每個試驗重復3次。試驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進行方差分析，Duncan法進行均值的多重比較。

1.3.6 Western blot方法檢測組織中蛋白水平的表達 收集細胞，裂解30 min，4 ℃ 1 200 g離心5 min，收集上清，測定蛋白濃度。(1)加入上樣緩沖液，沸水煮10 min。(2)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣10 μL，蛋白至分離膠，電壓由80 V切換為100V直至電泳結束。(3)轉(zhuǎn)膜用300 mA 的電流，4 ℃電泳1～2 h。(4)牛奶封閉2 h，一抗4 ℃過夜孵育、二抗37 ℃孵育2 h。(5)加入曝光液顯色5～10 min觀察結果。取3次曝光結果，通過ImageJ軟件測定WB條帶表達量，重復3次。

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色鑒定顆粒細胞

FSHR免疫細胞化學染色是卵巢顆粒細胞的特異性染色。收集正常培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞(圖1A)；進行FSHR免疫染色，陽性定位于細胞胞漿，呈棕褐色著染(圖1B)；陰性對照組并未檢測到陽性表達(圖1C)。

A．牦牛卵巢顆粒細胞培養(yǎng)照片(倒置顯微鏡 100×)；B.牦牛卵巢顆粒細胞FSHR免疫細胞化學染色，顆粒細胞呈陽性(400×)；C.牦牛顆粒細胞FSHR免疫細胞染色的陰性對照(400×)A.Cultured ovary granulosa cells of yak after 48 h(100×)；B.Immunohistochemical staining of FSHR in cultured yak ovary granulosa cells，and the nucleus of granulosa cells was positive for the expression of FSHR(400×)；C.The negative control of FSHR immunohistochemical staining in granulosa cells of yak(400×)圖1 牦牛卵巢顆粒細胞形態(tài)及免疫組化Fig.1 Morphological characteristic and immunohistochemistry of yak ovarian granular cells

2.2CIRBP的表達

2.2.1CIRBPmRNA表達 通過RT-PCR檢測CIRBP熒光定量引物，發(fā)現(xiàn)條帶單一，片段大小符合試驗設計(圖2A)。qRT-PCR檢測CIRBPmRNA的表達水平，細胞在25 ℃處理第1天時，CIRBP表達水平開始升高為對照組的1.5倍，在25 ℃培養(yǎng)第5天時，表達量為對照組的4.6倍。在25 ℃低溫處理5 d后，進行復溫培養(yǎng)，CIRBP表達量迅速下降，24 h后接近對照組表達水平(圖2B)。

2.2.2 CIRBP蛋白的表達 通過Western blot檢測CIRBP蛋白的表達情況，細胞在25 ℃處理第1天時，CIRBP表達水平開始升高為對照組的1.6倍，在25 ℃培養(yǎng)第5天時，表達量為對照組的18倍。在25 ℃低溫處理5 d后，進行復溫培養(yǎng)，CIRBP表達量迅速下降，24 h后為對照組表達水平3倍左右(圖2C和圖2D)。

2.3HSP70的表達

2.3.1HSP70 mRNA表達 通過RT-PCR檢測HSP70熒光定量引物，發(fā)現(xiàn)條帶單一，片段大小符合試驗設計(圖3A)。通過qRT-PCR檢測HSP70 mRNA的表達水平，細胞在25 ℃冷處理5 d期間,HSP70 mRNA表達量無顯著變化，然而,37 ℃復溫培養(yǎng)后，導致表達量逐步增加(8 h時高達對照組的4.7倍)，隨后下降(圖3B)。

2.3.2 HSP70蛋白表達 通過Western blot檢測HSP70蛋白的表達情況，細胞在25 ℃冷處理的5 d期間，HSP70蛋白的表達量無明顯變化，只在第5天有略微上升，為對照組的1.2倍。在25 ℃低溫處理5 d后進行復溫培養(yǎng)，HSP70表達量逐漸上升，8 h后達到峰值，為對照組的3.6倍，隨后表達量下降，24 h后為對照組表達水平2倍左右(圖3C和圖3D)。

表達量=平均值±SE，n=3，對照組0 d值確定為1。0 d.正常對照組，1 d和5 d.25 ℃培養(yǎng)1和5 d，1、2、4、8和24 h.25 ℃冷處理后，復溫37 ℃培養(yǎng)1、2、4、8和24 h。標有a，b，c，d不同字母的組間差異極顯著(P<0.01)，標有相同字母的組間無差異(P>0.05)。下同。A.CIRBP熒光定量引物的RT-PCR反應凝膠電泳圖；B.熒光定量PCR反應結果；C.CIRBP(19 ku)及β-actin(43 ku)蛋白Western blot結果；D.ImageJ對Western blot結果分析The expression are mean ± SE，n=3 .Values at 0 d were arbitrary taken as 1.0 d.The control group；1 d and 5 d.1 or 5 days at 25 ℃；1 h，2 h，4 h，8 h and 24 h.5 days at 25 ℃ followed by 1 to 24 h at 37 ℃.Different letters mean significant difference between the groups(P<0.01)，same letters mean no difference between groups(P>0.05).The same as below.A.The picture of RT-PCR amplification products with agarose gel electrophoresis；B.The qRT-PCR result of CIRBP mRNA levels；C.The picture is the Western blot expression of CIRBP(19 ku) and β-actin(43 ku) antibody；D.The ratio of CIRBP protein expressed quantity to β-actin protein expressed quantity calculated by the software ImageJ圖2 冷應激及復溫后CIRBP表達變化Fig.2 Cold-shock and rewarming affect CIRBP expression

A.HSP70熒光定量引物的RT-PCR反應凝膠電泳圖；B.熒光定量PCR反應結果；C.HSP70(70 ku)及β-actin(43 ku)蛋白Western blot結果；D.ImageJ對Western blot結果分析A.The picture of RT-PCR amplification products with agarose gel electrophoresis；B.The qRT-PCR result of HSP70 mRNA levels ；C.The picture is the Western blot expression of HSP70(19 ku) and β-actin(43 ku) antibody；D.The ratio of HSP70 protein expressed quantity to β-actin protein expressed quantity calculated by the software ImageJ圖3 冷應激及復溫后HSP70表達變化Fig.3 Cold-shock and rewarming affect HSP70 expression

2.4P53基因克隆和表達

2.4.1P53基因克隆 將P53-1及P53-2擴增得到的2段基因序列進行拼接(MEGA5軟件)，得到牦牛P53 mRNA序列，全長2 002 bp，并提交至GenBank(KF682141)。使用DNAman軟件分析可知牦牛P53 mRNA的編碼區(qū)為52～1 210 bp，全長1 159 bp，預測編碼蛋白大小約為43 ku。通過NCBI在線BLAST軟件分析發(fā)現(xiàn)牦牛P53 mRNA與家牛、瘤牛的序列相似性較高，達到99%，與印度水牛相似性為98%，與綿羊和野豬的相似性為95%(圖4A)。

2.4.2P53 mRNA的表達 通過RT-PCR檢測HSP70熒光定量引物，發(fā)現(xiàn)條帶單一，片段大小符合試驗設計(圖4B)，細胞在25 ℃冷處理5 d期間，P53 mRNA表達水平在第1天顯著上升約為對照組2倍，第5天則明顯下降，約為對照組表達量的一半。37 ℃復溫培養(yǎng)后，P53表達量迅速上升，在復溫培養(yǎng)4 h出現(xiàn)峰值，為對照組的4倍；8 h時明顯下降，隨后24 h又略微上升為對照組2倍(圖4C)。

3 討 論

A.牦牛P53基因進化樹；B.P53熒光定量引物的RT-PCR反應凝膠電泳圖；C.熒光定量PCR反應結果A.The phylogenetic tree of yak P53 with its closely related counterparts based on the P53 cDNA sequences；B.The picture of RT-PCR amplification products with agarose gel electrophoresis；C.The qRT-PCR result of P53 mRNA levels圖4 冷應激及復溫后P53 mRNA表達變化Fig.4 Cold-shock and rewarming affect P53 mRNA expression

筆者重點研究了在亞低溫及返回正常生理溫度時期，細胞內(nèi)CIRBP、HSP70、P53 mRNA和蛋白的變化規(guī)律及相互聯(lián)系，與其他學者研究結果相同，認為低溫能夠誘導一些基因的表達、RNA加工和細胞內(nèi)信號的重新編碼，并影響細胞形態(tài)和生存。此外，返回到生理溫度(37 ℃)后，冷應激造成的影響會持續(xù)或加劇[1，3，10]。在低溫冷處理期，基因轉(zhuǎn)錄和翻譯速率降低，但有一些特定的基因仍然能夠繼續(xù)以正常速率表達[2，22]，低溫也可以調(diào)節(jié)特定的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如CIRBP的表達水平與穩(wěn)定性[23]。BALB/3T3小鼠成纖維細胞CIRBP在各種冷處理溫度下持續(xù)表達，培養(yǎng)溫度從37 ℃降至32 ℃，6 h后，能夠誘導CIRBPmRNA和蛋白質(zhì)的顯著表達，在32 ℃培養(yǎng)24 h后，誘導CIRBPmRNA和蛋白的強烈表達，而在39或42 ℃培養(yǎng)時，CIRBP的表達下降[24]。同時，H.Nishiyama等還發(fā)現(xiàn)，對不同來源細胞系如小鼠TAMA26支持細胞、BMA1骨髓基質(zhì)細胞和HepG2人類肝癌細胞，進行溫和冷熱處理也會誘發(fā)上述類似的效應[24-25]。與上述報道一致，本研究顯示在25 ℃培養(yǎng)時，顆粒細胞CIRBP的表達量上升，復溫后，表達量返回到基礎水平。這表明低溫會誘導細胞CIRBPmRNA和蛋白表達水平的上升，可能有保護細胞免受冷應激損傷的作用。試驗結果中出現(xiàn)蛋白表達高于基因的情況，如：CIRBP蛋白的表達在25 ℃培養(yǎng)第5天時，基因的表達量為對照組的4.6倍(qRT-PCR)，而蛋白的表達量為對照組的18倍。在排除試驗誤差的情況下，qRT-PCR約是2n次方變化與Western blot不同，且兩種方法的敏感性不一樣，一個是拷貝數(shù)的差異，一個是微克數(shù)的變化。如果一種增加，另一種降低，這往往與RNA或蛋白在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性相關。如RNA穩(wěn)定性差，易降解，則出現(xiàn)RNA表達降低，蛋白表達相對增加，反之亦然。探究出現(xiàn)該結果的真正原因及相關調(diào)節(jié)機制，需要進行后續(xù)深入的研究證實。

E.Laios等[26]報道，大鼠心肌細胞在4 ℃低溫冷處理1 h，檢測不到HSP，然而37 ℃復溫2 h后，檢測到HSP70，復溫4～6 h，HSP70表達水平最高，在6 h后開始下降，同時他們還發(fā)現(xiàn)，細胞在4、10、15、20或25 ℃冷處理后，37 ℃復溫4 h，都可以檢測到HSP70。與其它過高熱研究結果一致，冷應激后返回到常溫會誘導細胞熱休克樣反應，HSP70表達水平在復溫后的8 h，表達量超過了常溫時期的正常水平[5，10，26]。本研究顯示，細胞HSP70 mRNA和蛋白表達水平在25 ℃溫和冷處理5 d期間，無顯著變化，然而37 ℃復溫導致其表達水平的逐步上升，隨后下降。這說明過高熱應激時檢測到熱休克的感應機制是相對的而不是絕對的，因為在復溫后的應激階段，同樣也會檢測到熱休克效應。

研究顯示，人類惡性膠質(zhì)瘤A-172細胞在4、15或20 ℃冷處理1 h，隨后37 ℃復溫培養(yǎng)10 h，會誘導P53積累[27]。此外，C.D.Gregory報道，體外培養(yǎng)的Burkitt淋巴瘤衍生的細胞系保留了親代細胞的增殖和細胞凋亡能力，將其在1 ℃冷處理20～30 min或25 ℃處理4 h，復溫培養(yǎng)1～2 h后，通過形態(tài)學特征和DNA片段檢測到細胞凋亡[28]。有關亞低溫對細胞凋亡的影響存在爭議，一些研究表明冷應激誘導細胞凋亡，而另一些研究認為它能夠抵抗隨后熱誘導的細胞凋亡，具有一定保護作用[28-29]。這些差異可能是由于所使用的細胞、溫度變化后的分析時間和分析方法不同所導致。在本研究的試驗模型中，溫和低溫處理期間，細胞凋亡因子P53 mRNA表達在第1天明顯上升，而在第5天明顯下降并低于正常水平，隨后復溫期間其表達量急劇增加，在4 h達到峰值后，8 h顯著下降。綜上可知，在CIRBP和HSP70 mRNA表達量達到峰值時，P53 mRNA的表達也顯著下降，有可能說明CIRBP和HSP70可保護細胞免受應激誘導的凋亡，具體機制需要進一步研究，以確定冷應激處理如何以及在多大程度上阻止或誘導細胞凋亡。

4 結 論

本研究對低溫本身的應激階段和復溫后的應激階段內(nèi)牦牛卵巢顆粒細胞內(nèi)CIRBP、HSP70和P53 mRNA及蛋白表達量進行了初探，研究結果對組織和器官的低溫儲存提供參考，并為研究生理低溫、治療低溫或意外低溫后復溫的適應性提供依據(jù)。

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(編輯 程金華)

Effects of Mild Cold Shock Followed by Warming Up at 37 ℃ on the Ovarian Granulosa Cellular Stress Response of the Yak

YANG Kun，ZHANG Qian，LI Gu-yue，PAN Yang-yang，YU Si-jiu，HE Jun-feng，CUI Yan*

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The cellular effects of hypothermia has been recognized a complex process including a stress response to cold and subsequent rewarming.In this study，real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot techniques were used to observe the dynamic expression ofCIRBP，HSP70 andP53 in the yak ovarian granulosa cells.Cells were preincubated at 25 ℃ for 1 and 5 d,and rewarmed at 37 ℃ for 1,2,4,8 and 24 h.The results showed that hypothermia and subsequent rewarming affected cell biology and induced a cellular stress response.The expression ofCIRBPwas increased at 25 ℃ already at day 1 and returned to basal level upon rewarming after 24 h.While the expression ofHSP70 was gradually increased upon rewarming at 37 ℃，maximal expression was occurred at 8 h after rewarming and followed by decline.Moreover the maximal expression ofP53 was appeared at 4 h after rewarming and followed by a decline.Additionally，the observation thatP53 mRNA was significantly decreased，a process that accompanied a maximal expression ofCIRBPandHSP70 mRNA，suggested that the expression ofCIRBPmRNA and protein was increased upon exposure to hypothermia，andHSP70 was induced upon rewarming.Overall，theCIRBPandHSP70 were shown to play a role in protecting cells from the deleterious effects of stress and apoptosis.These findings would bring new insights into the potential beneficial effects of mild hypothermia and rewarming used in various research and therapeutical fields.

yak；ovarian granulosa cells；mild cold shock；rewarm；CIRBP；HSP70；P53

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.008

2014-12-11

國家自然科學基金(31360594；31272616)

楊 琨(1986-)，男，山東諸城人，博士，主要從事動物組織學與胚胎學研究，E-mail：119260378@qq.com

*通信作者：崔 燕，教授，E-mail：cuiyan369@sina.com

S823.8+5.2

A

0366-6964(2015)05-0738-08