朱果真，黃梅清，陳仕龍，鄭 敏，程曉霞，陳少鶯*

(1.福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福州 350013)

感染新型鴨呼腸孤病毒雛番鴨和健康雛番鴨的肝蛋白質組學的差異

朱果真1，2，黃梅清1，2，陳仕龍1，2，鄭 敏1，2，程曉霞1，2，陳少鶯1，2*

(1.福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福州 350013)

應用差異蛋白質組學研究感染新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)番鴨后的肝和正常番鴨肝的蛋白質組差異，為深入研究NDRV的致病機制奠定良好理論基礎。通過二維雙向凝膠電泳技術和MALDI-TOF-TOF質譜儀分析獲取NDRV感染組與非感染對照組之間的差異表達蛋白質，并運用蛋白質搜索鑒定軟件Mascot 2.3.02鑒定蛋白質。結果共鑒定出26個差異表達蛋白質。感染組和非感染對照組比較，感染組肝中有9個表達下調的蛋白質和12個表達上調的蛋白質，3個表達蛋白質僅出現在非感染組，2個表達蛋白質僅出現在感染組。NDRV感染組的番鴨肝有肝細胞受損現象。差異蛋白質組學為NDRV分子發(fā)病機制的分析提供了一個新途徑。

番鴨；肝；差異蛋白質組學；新型鴨呼腸孤病毒

新型鴨呼腸孤病毒(novel duck reovirus，NDRV)是近年來中國水禽新發(fā)疫病“鴨出血壞死性肝炎”的病原[1]。NDRV有別于番鴨呼腸孤病毒(muscovy duck reovirus，MDRV)，具備感染多種水禽的特性，能感染番鴨、半番鴨、麻鴨和櫻桃谷鴨等鴨群。NDRV是借助哪些功能蛋白質的改變、抗原的突變從而獲得侵染多種不同宿主的能力，病毒如何通過變異實現跨宿主種間傳播的機制等，目前研究甚少。為了在此方面有所突破，作者應用雙向凝膠電泳、質譜鑒定技術來尋找NDRV感染宿主組織相關蛋白質以及希望借此了解病毒復制、與宿主相互作用以及引發(fā)疾病的機制。

1 材料與方法

1.1 病毒株及試驗動物

44只健康雛番鴨由莆田溫氏種鴨公司提供；NDRV-NP03株由福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物病毒研究室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑和儀器

IPG預制干膠條、IPG buffer、尿素、硫脲、碘乙酰胺、CHAPS、DTT、DeStreak試劑、2D clean-up試劑盒、蛋白質定量試劑盒2-D Quant kit，均購自GE Healthcare公司。Tris、SDS、甘氨酸、丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED購自Genview公司。蛋白酶抑制劑Complete ULTRA(mini EDTA-free EASYpack)購自Roche公司。考馬斯亮藍G-250購自Sigma公司。PageRuler Prestained Protein Ladder購自Thermo Scientific公司。其他試劑均為國產分析純。

Ettan IPGphor Ⅲ等電聚焦系統(tǒng)、Ettan IPGphor Manifold膠條槽、Ettan DALTsix大型垂直電泳系統(tǒng)、MultiTemp(tm) Ⅲ恒溫循環(huán)水浴、ImageScanner III 掃描儀均購自GE Healthcare 公司。雙向電泳凝膠圖像分析軟件PDQuest 8.0購自Bio-RAD公司。

1.3 番鴨肝的采集及樣品制備

44羽4日齡健康番鴨隨機分成2組，每組22只。試驗組每羽腿肌接種0.2 mL NDRV-NP03株細胞毒，對照組接種相同劑量的Hank’s液，同條件隔離飼養(yǎng)，無菌采集感染后第5天的番鴨肝。用-70 ℃預冷的研缽將肝組織磨成粉末，加入10 mL含總蛋白酶抑制劑的裂解液溶解，然后進行超聲波處理，裂解5次，每次持續(xù)2 s，間隔10 s，室溫下放置30 min，于15 ℃ 40 000 g離心1 h，取上清。按2-D-clean up kit試劑盒方法純化蛋白質，用2-D Quant kit蛋白質定量試劑盒測定蛋白質質量濃度，分裝至Eppendof管中，-70 ℃冰箱保存。

1.4 雙向電泳

1.4.1 第一向等電聚焦 選擇24 cm Immobiline DryStrip(pH 3-11)，根據1 100 μg的蛋白質上樣量，450 μL的上樣總體積，將制備好的樣品加入水化上樣緩沖液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、2% CHAPS、0.5% IPG buffer、0.002%溴酚藍儲備溶液、0.012% DeStreak試劑)。上樣后，根據表1中的參數進行第一向等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)。聚焦溫度20 ℃，每根膠條限流50 μA。

表1 等電聚焦參數

Table 1 Parameters of isoelectric focusing

步驟Step升壓模式Step-upmode電壓/VVoltage時間/hDuration伏小時數/VhVolt-hourStep1Step5012-Step2Step2001.5-Step3Step5001-Step4Grad10001-Step5Grad80003-Step6Step8000-60000Step7Step50010-

1.4.2 第二向垂直SDS-PAGE 等電聚焦完成后，將IPG膠條進行兩次平衡處理。第一次平衡時，每個平衡試管中加15 mL SDS平衡緩沖液(加入150 mg DTT)，第二次平衡時，倒出上一步驟中的液體，再向每個平衡試管中加15 mL SDS平衡緩沖液(加入600 mg碘乙酰胺)，每次平衡15 min。后移至12%的丙烯酰胺均一凝膠中進行垂直SDS-PAGE電泳。電泳條件：3 W·gel-1電泳45 min后，45 W·gel-1電泳約3 h，當溴酚藍指示劑到達玻璃板底部約1 cm時終止電泳。

1.4.3 凝膠染色與圖像分析 電泳結束后采用膠體考馬斯亮藍G250染色液(最終體積分數：10%磷酸，10%硫酸銨，0.12%考馬斯亮藍G250，20%乙醇)進行染色。Image Scanner掃描儀透射掃描凝膠，分辨率300 dpi保存圖像。Bio-Rad蛋白質組雙向電泳圖像分析軟件PDQest8.0對圖像進行點檢測、編輯、點匹配及數據分析。

1.5 差異表達蛋白質點的鑒定與分析

根據電泳圖像分析結果，選取差異表達蛋白質點送深圳華大科技基因服務有限公司進行MALDI-TOF-TOF質譜分析，差異表達蛋白質點包括了僅存在于某一組2-DE電泳圖譜中的蛋白質點，以及表達水平超過3倍的蛋白質點。使用蛋白質搜索鑒定軟件Mascot 2.3.02，結合NCBI和GO數據庫對差異表達蛋白質點進行亞細胞定位和功能分類。

2 結 果

2.1 雛番鴨肝病變及樣品制備

雛番鴨攻毒試驗共進行7 d。在攻毒后第3天肝出現少量不規(guī)則斑塊狀壞死和出血，第5天出現大量不規(guī)則壞死和出血斑(圖1)，病理變化過程與之前研究者試驗結果[2]一致。本研究中的樣品采用攻毒后第5天的番鴨肝。取典型病變肝制備的樣品總蛋白質質量濃度均在5～10 mg·mL-1，且每個蛋白質質量濃度均互相接近，符合雙向電泳樣品要求。

A.對照組番鴨肝；B.NDRV感染組番鴨肝A.Livers of muscovy duckling from the control；B.Livers of muscovy duckling from the treatment圖1 攻毒后第5天對照組和NDRV感染組番鴨肝Fig.1 Liver lesions and colors of muscovy ducklings of the control and the treatment at the 5th day after challenge

2.2 2-DE圖譜

將上述制備的試驗組和對照組番鴨肝蛋白質樣品進行三次重復雙向電泳，經考馬斯亮藍G250染色后發(fā)現3次重復電泳圖譜基本一致(圖2)，絕大部分點都處于凝膠上的同一位置，僅個別點由于個體差異處于稍偏位置，試驗重復性較高。在雙向電泳圖譜中，PageRuler Prestained Protein Ladder從上至下的條帶相對分子質量為170、130、100、70、55、40、35、25、15和10 ku，兩張圖中大部分蛋白質點位于25～100 ku，蛋白質相對分子質量小于10 ku的蛋白質幾乎沒有。用PDQest8.0進行圖像差異比對分析，選取差異蛋白質點進行質譜鑒定，最后確定32個膠點蛋白中，鑒定到的蛋白質為26個，鑒定到蛋白質的樣品占總樣品的數量百分比為81.25%，見表2～5。

2.3 差異表達蛋白點的亞細胞定位

使用NCBI數據庫和GO數據庫分析26個差異表達蛋白質亞細胞分布情況。蛋白質點位于細胞質為3.70%，定位未明確的蛋白質點為96.30%。因為鴨的蛋白質組數據庫信息不全，大多數蛋白質都是預測為某種蛋白質，所以這些蛋白質難以進行亞細胞定位。

圖2 對照組和NDRV感染組番鴨肝蛋白質的代表性雙向電泳圖譜Fig.2 Proteomic patterns of the livers by two-dimensional gel electrophoresis

2.4 差異表達蛋白質點的功能分類

根據Panther Classification System分析的結果，NDRV組中26個蛋白質可以歸類為結合功能(35.7%)、催化活性(35.7%)、轉錄調節(jié)活性(14.3%)和轉運體活性(14.3%)。

從上述數據可以推測NDRV組中具有結合功能和具有催化活性的蛋白質最易受到番鴨呼腸孤病毒感染的影響。

3 討 論

3.1 視神經系統(tǒng)受損

NCK銜接蛋白5(Nck-associated protein 5)是一種接頭蛋白，人類醫(yī)學認為它的缺乏會引起多動癥、躁郁癥等疾病。NDRV組中類NCK銜接蛋白5的表達下調可能會引起番鴨的精神亢奮，作用機制有待研究。β-脲基丙酸酶(beta-ureidopropionase)的缺乏會引起神經系統(tǒng)異常[3]，肌張力低下，部分視神經萎縮等癥狀。Protein quail neuroretina 1在神經視網膜細胞的增殖和分化中起著重要的作用。這兩種蛋白質的表達減弱可能提示發(fā)病番鴨視神經系統(tǒng)損傷，但是發(fā)病番鴨臨床癥狀中未見報道，此現象有待觀察和進一步研究。

3.2 細胞凋亡

丙氨酰-tRNA合成酶(alanyl-tRNA synthetase)屬于II類氨酰-tRNA合成酶家族。在蛋白質合成中起著重要作用，另外還參與tRNA的加工、RNA 的剪接、凋亡、轉錄及翻譯調控等[4]。發(fā)病番鴨的丙氨酰-tRNA合成酶表達減弱提示可能存在細胞凋亡現象。此外參與細胞凋亡的3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)表達也增強。有研究表明，在細胞發(fā)生凋亡過程中，GAPDH進入細胞核，通過一氧化氮介導的信號轉導途徑激活GAPDHS-亞硝基化，并通過與Siah1結合誘導細胞凋亡[5]。

3.3 肝功能異常和自我修復

NDRV組中出現了L-乳酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶均表達增強，血紅蛋白表達增強，谷氨酰胺合成酶表達減弱，說明有肝細胞受損。

人體中L-乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase)高表達常見于乙肝患者或由于肺梗塞、惡性貧血、休克及腫瘤轉移所致的胸腹水患者。血紅蛋白增多，常見于某些腫瘤或腎臟疾病，如肝細胞癌、腎癌等。

谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)催化谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸和氨的反應。亞細胞定位一直被認為是在線粒體中，但有研究表明，哺乳動物的谷氨酸脫氫酶不但存在于線粒體中，還存在于內質網中[6]。ATP與GTP是該酶的變構抑制劑，而ADP和GDP是變構激活劑。因此，當體內的能量不足時能加速氨基酸的氧化，對機體的能量代謝起到重要的調節(jié)作用。NDRV組中谷氨酸脫氫酶升高提示肝小葉中線粒體損害，肝細胞受到損傷。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)是一種控制氮代謝的酶。GS催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺，同時消耗ATP。自由的銨離子對生物有毒性，不能過多存在于血液中，谷氨酰胺就是運輸多余的銨離子。GS表達減弱，說明機體體內氮代謝失衡，銨離子過多，影響肝功能。但是同時又檢測到α-谷胱甘肽S-轉移酶表達減弱，表明肝功能處于恢復中。α-谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase class-alpha)是肝實質細胞中具有解毒作用的一種蛋白質，在毒理學上有一定的重要性。有研究者發(fā)現，α-谷胱甘肽S-轉移酶的高低與肝細胞破壞程度有良好的一致性[7]，能靈敏地反映肝細胞破壞程度，并且易釋放入血，所以人類醫(yī)學將血清中該酶的水平作為估計肝細胞破壞程度和肝功能異常的一個客觀指標[8]。

NDRV組中出現了過氧化物酶升高，說明機體在積極消除過氧化氫。過氧化物酶體大量存在于肝細胞和腎細胞中，在氧化底物的同時，將氧還原成過氧化氫，之后水解掉過氧化氫，起到保護細胞作用。

3.4 病毒通過膜融合方式進入細胞

早期內涵體抗原1(early endosome antigen 1，EEA1)是位于早期內涵體細胞質面的親水性外在膜蛋白，在內吞過程中控制著細胞質囊泡融合[9]。多數研究表明，許多病毒首先進入早期蛋白酶體[10-11]。本試驗中，EEA1在NDRV組中沒有檢測到，僅在正常組中檢測到，提示病毒可能早已通過膜融合等方式進入細胞。

4 結 論

應用差異蛋白質組學技術研究感染新型鴨呼腸孤病毒番鴨后的肝和正常番鴨肝的蛋白質組差異，共鑒定出26個差異表達蛋白質：感染組肝中有9個表達下調的蛋白質和12個表達上調的蛋白質，3個表達蛋白質僅出現在非感染組，2個表達蛋白質僅出現在感染組。

[1] 陳少鶯，陳仕龍，林鋒強，等.新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].病毒學報，2012，28(3)：224-230. CHEN S Y，CHEN S L，LIN F Q，et al.The isolation and identification of novel duck reovirus[J].ChineseJournalofVirology，2012，28(3)：224-230.(in Chinese)[2] 陳仕龍，陳少鶯，程曉霞，等.新型鴨呼腸孤病毒分離株的致病性研究[J].西北農林科技大學學報(自然科學版)，2010，38(4)：14-18. CHEN S L，CHEN S Y，CHENG X X，et al.The study on the pathogenicity of new type duck reovirus[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(Nat.Sci.Ed.)，2010，38(4)：14-18.(in Chinese)

[3] VAN KUILENBURG A B，MEINSMA R，BEKE E，et al.beta-Ureidopropionase deficiency：an inborn error of pyrimidine degradation associated with neurological abnormalities[J].HumMolGenet，2004，13(22)：2793-2801.

[4] 唐素妮，黃京飛.氨酰-tRNA 合成酶的進化差異[J].動物學研究，2007，28(5)：563-567. TANG S N，HUANG J F.Evolutionary diversities of aminoacyl-tRNA synthetases[J].ZoologicalResearch，2007，28(5)：563-567.(in Chinese)

[5] HARA M R，AGRAWAL N，KIM S F，et al.S-nitrosylated GAPDH initiates apoptotic cell death by nuclear translocation following Siah1 binding[J].NatCellBiol，2005，7(7)：665-674.

[6] MASTORODEMOS V，KOTZAMANI D，ZAGANAS I，et al.Human GLUD1 and GLUD2 glutamate dehydrogenase localize to mitochondria and endoplasmic reticulum[J].BiochemCellBiol，2009，87(3)：505-516.

[7] 胡大榮，李夢東，關金鈴，等.血清谷胱甘肽S-轉移酶檢測在肝臟疾病中的意義[J].中華傳染病雜志，1988，6(3)：141-144. HU D R，LI M D，GUAN J L，et al.Clinical significance of serum glutathone S-transferase measure ment in liver diseases[J].ChineseJournalofInfectiousDiseases，1988，6(3)：141-144.(in Chinese)

[8] 戴 東，曾憲成，李國光，等.急性膽管炎病人血清α-谷胱甘肽-S-轉移酶的檢測及意義[J].延邊大學醫(yī)學學報，2002，25(3)：184-186. DAI D，ZENG X C，LI G G，et al.Detecting and its significance of serum α-glutathione-S-transferase in patients of acute cholangitis[J].JournalofMedicalScienceYanbianUniversity，2002，25(3)：184-186.(in Chinese)

[9] SELAK S，PATERNAIN A V，FRITZLER M J，et al.Human autoantibodies against early endosome antigen-1 enhance excitatory synaptic transmission[J].Neuroscience，2006，143(4)：953-964.

[10] WEINGARTL H M，RIVA J，KUMTHEKAR P.Molecular characterization of avian paramyxovirus 1 isolates collected from cormorants in Canada from 1995 to 2000[J].JClinMicrobiol，2003，41(3)：1280-1284.[11] ALLANDER T，EMERSON S U，ENGLE R E，et al.A virus discovery method incorporating DNase treatment and its application to the identification of two bovine parvovirus species[J].ProcNatlAcadSciUSA，2001，98(20)：11609-11614.

(編輯 白永平)

Differential Proteomics in Livers of Muscovy Ducklings in Health and Challenged with Novel Duck Reovirus

ZHU Guo-zhen1，2，HUANG Mei-qing1，2，CHEN Shi-long1，2，ZHENG Min1，2，CHENG Xiao-xia1，2，CHEN Shao-ying1，2*

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，FujianAcademyofAgriculturalSciences，Fuzhou350013，China；2.FujianAnimalDiseasesControlTechnologyDevelopmentCenter，Fuzhou350013，China)

The purpose of this paper was to study the pathogenesis of novel duck reovirus(NDRV) infected muscovy duckling.Forty-four healthy muscovy ducklings were divided into treatment group challenged with NDRV and control one injected with Hank′s.Livers were collected from both groups at the 5thday after challenge.Proteomics of the livers were determined by differential proteomic technology.Differential protein spots between both groups were performed and analyzed by two-dimensional gel electrophoresis and MALDI-TOF-TOF mass spectrometer，and then they were identified by protein search software，Mascot 2.3.02.Twenty-six differential protein spots were separated and identified.Nine down-regulated protein spots and twelve up-regulated protein spots were observed in the liver samples of the treatment after comparison between the two groups.Three protein spots were appeared only in the livers of control and two protein spots are only emerged in the livers of treatment.The results indicate that differential proteomics in livers，which were impacted and damaged by NDRV may provide a new idea of pathogenesis of NDRV infected muscovy duckling.

muscovy duck；liver；differential proteomics；novel duck reovirus

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.017

2014-09-10

國家自然科學基金(31172334)；國家863項目(2011AA10A209)；福建省自然科學基金(2014J01106)

朱果真(1986-)，女，安徽池州人，碩士，主要從事預防獸醫(yī)學研究，E-mail：gzmzxz2010@163.com

*通信作者：陳少鶯，Tel： +86-591-87884914，E-mail：chensy58@163.com

S852.659.4

A

0366-6964(2015)05-0808-07