賀 綦，孫嬰寧，李 輝*，王啟貴

(1.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030； 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030； 4.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

雞L-FABP啟動(dòng)子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變分析

賀 綦1，2，3，孫嬰寧1，2，3，李 輝1，2，3*，王啟貴1，2，4*

(1.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030； 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030； 4.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

為進(jìn)一步分析L-FABP啟動(dòng)子區(qū)域中的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)以確定其在L-FABP轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。本研究采用定點(diǎn)突變方法將L-FABP啟動(dòng)子區(qū)域中的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行有效突變。結(jié)果顯示，C/EBPα外源過表達(dá)可以抑制L-FABP啟動(dòng)子活性，突變L-FABP啟動(dòng)子區(qū)域中C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)后L-FABP的啟動(dòng)子活性明顯升高。這些結(jié)果表明，雞L-FABP基因受到C/EBPα基因負(fù)調(diào)控作用，且C/EBPα很可能通過與該位點(diǎn)結(jié)合參與L-FABP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，為進(jìn)一步研究C/EBPα在L-FABP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用提供重要依據(jù)。

雞；L-FABP基因；啟動(dòng)子；定點(diǎn)突變；C/EBPα基因

肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(Liver-type fatty acid binding protein，L-FABP，F(xiàn)ABP1)屬于脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)家族的成員之一，是一組低分子量(14～15 ku左右)可以結(jié)合長(zhǎng)鏈脂肪酸的高保守性胞質(zhì)蛋白。目前，對(duì)L-FABP的功能研究主要集中在人與小鼠上[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，L-FABP與不飽和脂肪酸的協(xié)同作用可有效促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[2]。F.Schroeder等[3]研究發(fā)現(xiàn)，L-FABP基因的表達(dá)與胚胎干細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。E.P.Newberry等[4]利用基因剔除模型研究顯示，在長(zhǎng)期禁食狀態(tài)下，L-FABP基因剔除的小鼠肝對(duì)脂肪酸的攝入量少于野生型。

雞L-FABP基因只在肝和小腸中表達(dá)[5]，與哺乳動(dòng)物L(fēng)-FABP蛋白結(jié)構(gòu)相似[6]。已經(jīng)研究證實(shí)，PPAR元件、甾族調(diào)節(jié)元件SRE、C/EBPα和AP1等是人L-FABP基因啟動(dòng)子的重要順式作用元件[7]。C/EBPα基因是第1個(gè)被證明在脂肪細(xì)胞分化過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。通過在3T3-Ll前脂肪細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞的分化過程中必須要有C/EBPα。在小鼠體內(nèi)將C/EBPα基因干擾，發(fā)現(xiàn)小鼠的白色脂肪組織發(fā)育停滯[8]。本研究前期對(duì)雞L-FABP啟動(dòng)子進(jìn)行鑒定與分析，推測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)存在1個(gè)C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)，受到C/EBPα基因負(fù)調(diào)控作用[9]。

為進(jìn)一步分析L-FABP啟動(dòng)子區(qū)域中C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)的真實(shí)性和確切位置，本研究采用定點(diǎn)突變的方法對(duì)L-FABP啟動(dòng)子區(qū)域中的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析，為闡明C/EBPα在L-FABP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Dual-Luciferase?Reporter Assay System)、螢光素酶報(bào)告基因載體(pGL3-basic vector)、海腎熒光素酶報(bào)告基因載體(pRL-TK vector)購(gòu)自Promega公司；質(zhì)?；厥赵噭┖匈?gòu)自O(shè)miga公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；Fast Mutagenesis System購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；C/EBPα真核表達(dá)載體和L-FABP(-2076/-20)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；人肝癌細(xì)胞系(HEGP2)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 采用Mulan和TFSEARCH 軟件對(duì)L-FABP(-2 076/-20)啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析。

1.2.2 定點(diǎn)突變重組體的構(gòu)建 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果對(duì)L-FABP啟動(dòng)子區(qū)域的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)突變引物并命名為L(zhǎng)-FABP-F-mC/EBPα和L-FABP-R-mC/EBPα(表1)。以pGL3-L-FABP(-2 076/-20)質(zhì)粒為模板構(gòu)建突變重組體L-FABP-mC/EBPα。定點(diǎn)突變參照Fast Mutagenesis System試劑說明書操作。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 3 min，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3 人肝癌細(xì)胞系細(xì)胞(HEGP2)的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肝癌細(xì)胞系(HEPG2)用含有濃度為100 U·mL-1青霉素和鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)；0.25%胰酶消化液消化；2 d傳代一次；細(xì)胞的轉(zhuǎn)染使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作。

表1 構(gòu)建啟動(dòng)子突變體所用引物序列

Table 1 Primers used for promoter mutation

引物名稱Primername引物序列(5′?3′)SequencesofprimerL?FABP?F?mC/EBPαCTGAGATTTGTCCGCATGCTCCCAATTGL?FABP?R?mC/EBPαGCGGACAAATCTCAGATTAAAGGAGGAG

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)雞L-FABP基因啟動(dòng)子活性影響 HEGP2細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合時(shí)，將C/EBPα真核表達(dá)載體分別與雞pGL3-L-FABP(-2 076/-20)和突變重組體pGL3-L-FABP-mC/EBPα啟動(dòng)子報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染HEGP2細(xì)胞作為試驗(yàn)組；pCMV-HA載體分別與雞pGL3-L-FABP(-2 076/-20)和突變重組體pGL3-L-FABP-mC/EBPα啟動(dòng)子報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染HEGP2細(xì)胞作為對(duì)照組。海腎熒光素酶報(bào)告基因?yàn)閮?nèi)源參照。每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染1 μg質(zhì)粒(表達(dá)載體∶啟動(dòng)子報(bào)告基載體質(zhì)量比為3∶2)，0.01 μg的海腎對(duì)照質(zhì)粒(PRL-PK)轉(zhuǎn)染48 h，回收細(xì)胞，檢測(cè)雙報(bào)告基因熒光素酶活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析與t檢驗(yàn)。P<0.05為差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1L-FABP啟動(dòng)子區(qū)域的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)分析

利用Mulan(http：//mulan.dcode.org)和TFSEARCH(http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)網(wǎng)站分析雞L-FABP(-2 076/-20)啟動(dòng)子序列上轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)置Threshold：85.0 point。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在雞L-FABP(-2 076/-20)啟動(dòng)子序列區(qū)間存在1個(gè)C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合在L-FABP翻譯起始位點(diǎn)上游-1 854/-1 841，結(jié)合序列為agatttgtcAAtat。兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.2 定點(diǎn)突變重組體的構(gòu)建與鑒定

以L-FABP基因啟動(dòng)子(-2 076/-20)質(zhì)粒為模板，利用L-FABP-F-mC/EBPα：5′-CTGAGA-TTTGTCCGCATGCTCCCAATTG-3′，L-FABP-R-mC/EBPα：5′-GCGGACAAATCTCAGATTAA-AGGAGGAG-3′為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到一條約6 874 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期的結(jié)果大小一致。菌液提交立菲公司進(jìn)行測(cè)序(圖2)。結(jié)果顯示L-FABP-mC/EBPα啟動(dòng)子點(diǎn)突變載體構(gòu)建成功。

2.3C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變重組體的啟動(dòng)子活性分析

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.原質(zhì)粒為模板點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物；2.模板稀釋10倍點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物； 3.模板稀釋100倍點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物；4.模板稀釋1 000倍點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物M.Trans2K Plus П DNA marker(5 μL)；1-4.PCR products of site-directed mutagenesis，plasmid as templates respectively diluted 10，100，1 000 times圖1 C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)突變重組體質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of the C/EBPα binding sites mutant

為檢測(cè)C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)的突變是否影響L-FABP啟動(dòng)子的活性，將L-FABP啟動(dòng)子突變體與C/EBPα表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞。48 h后分別檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果表明：1)C/EBPα的外源過表達(dá)可以抑制野生型L-FABP的啟動(dòng)子活性(P=0.028 0)。2)突變L-FABP的啟動(dòng)子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)，C/EBPα外源過表達(dá)后L-FABP的啟動(dòng)子活性增強(qiáng)(P=0.019 2)。3)突變型L-FABP與野生型L-FABP相比突變型L-FABP的啟動(dòng)子活性高于野生型L-FABP啟動(dòng)子活性(P=0.003 5)。4)外源過表達(dá)C/EBPα，突變型L-FABP啟動(dòng)子活性高于野生型L-FABP啟動(dòng)子活性(P=0.002 2)(圖3)。這些結(jié)果說明，C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)得到有效突變，也暗示了C/EBPα對(duì)L-FABP啟動(dòng)子活性的抑制效應(yīng)是通過該結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用的。

3 討 論

L-FABP基因?qū)?xì)胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、脂質(zhì)合成及長(zhǎng)鏈脂肪酸依賴性基因的調(diào)控具有重要作用[10-11]。筆者前期通過對(duì)雞L-FABP多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，L-FABP基因可能是影響雞脂肪性狀的重要候選基因[12]。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)L-FABP的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)L-FABP的啟動(dòng)子區(qū)域含有C/EBPα等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[13]。雞L-FABP基因受到C/EBPα基因負(fù)調(diào)控作用，且突變L-FABP啟動(dòng)子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)后失去對(duì)L-FABP啟動(dòng)子的抑制作用。

目前，大量研究證實(shí)C/EBPα蛋白對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是多層次多因子的復(fù)雜精細(xì)調(diào)控。其與多種蛋白因子相互協(xié)調(diào)，在脂肪細(xì)胞增殖分化、脂肪沉積、胚胎發(fā)育、機(jī)體能量代謝、免疫反應(yīng)及多種疾病過程中發(fā)揮重要作用[14-16]。C/EBP基因序列在人和雞之間高度保守[8，17]。在不同物種間C/EBPs家族都是具有重要生物學(xué)作用的功能基因[18-19]。C/EBPα能與Ap2、SCD1、GluT4、leptin等脂肪細(xì)胞特征的啟動(dòng)子位點(diǎn)相結(jié)合并激活其表達(dá)，而突變這些基因啟動(dòng)子區(qū)的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)，則C/EBPα對(duì)其無激活效應(yīng)[20]。本研究的結(jié)果顯示，C/EBPα外源過表達(dá)可以抑制L-FABP啟動(dòng)子活性，與筆者前期研究結(jié)果一致[9]。采用定點(diǎn)突變方法將L-FABP啟動(dòng)子區(qū)域中C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變后，L-FABP的啟動(dòng)子活性明顯升高。L-FABP突變體啟動(dòng)子與C/EBPα共轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞中，L-FABP突變體啟動(dòng)子活性顯著增強(qiáng)。通過生物信息學(xué)分析顯示雞L-FABP基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)PPARγ結(jié)合位點(diǎn)。丁寧[21]研究顯示，雞C/EBPα基因表達(dá)蛋白能夠結(jié)合于PPARγ基因啟動(dòng)子區(qū)，并顯著激活其轉(zhuǎn)錄。有報(bào)道顯示，adipophilin、L-FABP、RegIA、Gob-4 和NGAL這5個(gè)基因是由PPARγ直接調(diào)控的靶基因[22]，此外激活的PPARγ可誘導(dǎo)L-FABP的表達(dá)，從而有效地轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)并促進(jìn)其代謝[23]。因此推測(cè)，這有可能是轉(zhuǎn)染C/EBPα反而造成了L-FABP突變體啟動(dòng)子區(qū)域其它轉(zhuǎn)錄因子如PPARγ等的結(jié)合量相應(yīng)升高進(jìn)而促進(jìn)了L-FABP突變體啟動(dòng)子活性，但該推測(cè)還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

下劃線標(biāo)示位置為預(yù)測(cè)C/EBPα結(jié)合序列，箭頭標(biāo)示位置為點(diǎn)突變位置，由AAT突變?yōu)镃GCUnderline indicate the predicted C/EBPα sequence，arrow label position for the point mutation，by the AAT mutated into CGC圖2 L-FABP啟動(dòng)子區(qū)點(diǎn)突變測(cè)序結(jié)果Fig.2 The sequencing of L-FABP promoter region site-directed mutagenesis

*表示差顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)*.Means differ significantly(P<0.05)；**.Means highly differ significantly(P<0.01)圖3 定點(diǎn)突變技術(shù)分析雞L-FABP基因啟動(dòng)子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響Fig.3 Mutation analysis of the function of C/EBPα binding site in the minimal L-FABP promoter region

L-FABP 是肝中唯一表達(dá)的脂肪酸結(jié)合蛋白，介導(dǎo)脂肪酸及多種疏水基團(tuán)的轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究使用人肝癌細(xì)胞系HEPG2作為試驗(yàn)材料探索L-FABP轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。由于L-FABP基因及轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα在雞和人肝中都有表達(dá)且L-FABP、C/EBPα基因氨基酸序列保守性很高，人肝組織中的環(huán)境與禽類肝所提供的環(huán)境相似，因此推測(cè)在人和雞的L-FABP基因具有相同的調(diào)控機(jī)制，雞L-FABP基因受到C/EBPα基因負(fù)調(diào)控作用，并且C/EBPα很可能通過與該位點(diǎn)結(jié)合參與L-FABP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

[1] LOWE J B，BOGUSKI M S，SWEETSER D A，et al.Human liver fatty acid binding protein.Isolation of a full length cDNA and comparative sequence analyses of orthologous and paralogous proteins[J].JBiolChem，1985，260(6)：3413-3417.

[2] SOROF S.Modulation of mitogenesis by liver fatty acid binding protein[J].CancerMetastasisRev，1994，13(3-4)：317-336.

[3] SCHROEDER F，ATSHAVES B P，STARODUB O，et al.Expression of liver fatty acid binding protein alters growth and differentiation of embryonic stem cells[J].MolCellBiochem，2001，219(1-2)：127-138.

[4] NEWBERRY E P，XIE Y，KENNEDY S，et al.Decreased hepatic triglyceride accumulation and altered fatty acid uptake in mice with deletion of the liver fatty acid-binding protein gene[J].JBiolChem，2003，278(51)：51664-51672.

[5] 石 慧，王啟貴 王宇祥，等.雞L-FABP抗血清制備及組織表達(dá)特性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39(11)：1466-1469. SHI H，WANG Q G，WANG Y X，et al.Preparation of antiserums against chicken liver-type fatty acid binding protein (L-FABP) and tissue expression analyses of L-FABP[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2008，39(11)：1466-1469.(in Chinese)

[6] HE Y，YANG X，WANG H，et al.Solution-state molecular structure of apo and oleate-liganded liver fatty acid-binding protein[J].Biochemistry，2007，46(44)：12543-12556.

[7] MURAI A，F(xiàn)URUSE M，KITAGUCHI K，et al.Characterization of critical factors influencing gene expression of two types of fatty acid-binding proteins(L-FABP and Lb-FABP) in the liver of birds[J].CompBiochemPhysiolAMolIntegrPhysiol，2009，154(2)：216-223.

[8] 張愛朋，王守志，王啟貴，等.雞C/EBPα基因的多態(tài)性與生長(zhǎng)和體組成性狀的相關(guān)研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18(4)：746-752. ZHANG A P，WANG S Z，WANG Q G，et al.Polymorphisms ofC/EBPαgene associated with growth and body composition traits in chickens[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2010，18(4)：746-752.(in Chinese)

[9] 賀 綦，史洪巖，王海霞，等.雞轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα、KLF2、KLF3、KLF7、PPARα對(duì)L-FABP啟動(dòng)子活性的影響[J].中國(guó)畜牧雜志，2014，50(17)：13-17. HE Q，SHI H Y，WANG H X，et al.The transcriptional activity ofL-FABPpromoter regulated by transcription factors C/EBPα，KLF2，KLF3，KLF7 and PPARα in chicken[J].ChineseJournalofAnimalScience，2014，50(17)：13-17.(in Chinese)

[10] TAN N S，SHAW N S，VINCKENBOSCH N，et al.Selective cooperation between fatty acid binding proteins and peroxisome proliferator-activated receptors in regulating transcription[J].MolCellBiol，2002，22(14)：5114-5127.

[11] WOLFRUM C，BORRMANN C M，BORCHERS T，et al.Fatty acids and hypolipidemic drugs regulate peroxisome proliferator-activated receptors alpha-and gamma-mediated gene expression via liver fatty acid binding protein：a signaling path to the nucleus[J].ProcNatlAcadSciUSA，2001，98(5)：2323-2328.

[12] 王啟貴.雞FABP基因克隆、表達(dá)特性及功能研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004. WANG Q G.Cloning，expression and function of chicken FABP genes[D].Harbin：Northeast Agricultural University，2004.(in Chinese)

[13] 高廣亮，冷 麗，張會(huì)豐，等.雞肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子活性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32(9)：1344-1348. GAO G L，LENG L，ZHANG H F，et al.Activity analysis of chicken liver fatty binding protein gene promoter[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2012，32(9)：1344-1348.(in Chinese)

[14] FAJAS L，F(xiàn)RUCHART J C，AUWERX J.Transcriptional control of adipogenesis[J].CurrOpinCellBiol，1998，10(2)：165-173.

[15] 王 娉，王啟貴，李 輝，等.雞C/EBP-α基因表達(dá)載體的構(gòu)建及抗血清制備[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志 2007，23(10)：978-981. WANG P，WANG Q G，LI H，et al.Expression vector construction of chicken C/EBP-α and preparation of antiserums against C/EBPα[J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology，2007，23(10)：978-981.(in Chinese)

[16] CONSTANCE C M，MORGAN J I T，UMEK R M.C/EBPalpha regulation of the growth-arrest-associated gene gadd45[J].MolCellBiol，1996，16(7)：3878-3883.

[17] MCLNTOSH A L，ATSHAVES B P，HOSTETLER H A，et al.Liver type fatty acid binding protein(L-FABP) gene ablation reduces nuclear ligand distribution and peroxisome proliferator-activated receptor-alpha activity in cultured primary hepatocytes[J].ArchBiochemBiophys，2009，485(2)：160-173.

[18] ZEILINGER S，EBNER A，MAROSITS T，et al.The hypocrea jecorina HAP 2/3/5 protein complex binds to the inverted CCAAT-box(ATTGG) within the cbh2(cellobiohydrolase II-gene) activating element[J].MolGenetGenomics， 2001，266(1)：56-63.

[19] HYNES M J，DRAHT O W，DAVIS M A.Regulation of the acuF gene，encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase in the filamentous fungus Aspergillus nidulans[J].JBacteriol， 2002，184(1)：183-190.

[20] MACDOUGALD O A，LANE M D.Transcriptional regulation of gene expression during adipocyte differentiation[J].AnnuRevBiochem，1995(64)：345-373.

[21] 丁 寧.雞轉(zhuǎn)錄因子PPARγ及C/EBPα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010. DING N.The transcriptional regualation of chicken transcription factor PPAR and C/EBPα genes[D].Harbin：Northeast Agricultural University，2010.(in Chinese)

[22] 白明華，馬紅兵，王西京，等.PPARγ對(duì)人胰腺癌細(xì)胞中抑癌基因PTEN表達(dá)的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2008，24(7)：717-720. BAI M H，MA H B，WANG X J，et al.Effects of activated PPARγ on the expression of PTEN gene in pancreatic cancer cells[J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology，2008，24(7)：717-720.(in Chinese)

[23] BERGER J，MOLLER D E.The mechanisms of action of PPARs[J].AnnuRevMed，2002，53：409-435.

(編輯 郭云雁)

Site Directed Mutagenesis forC/EBPαBinding Sites in ChickenL-FABPPromoter

HE Qi1，2，3，SUN Ying-ning1，2，3，LI Hui1，2，3*，WANG Qi-gui1，2，4*

(1.KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreeding，MinistryofAgriculture，Harbin150030，China； 2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，EducationDepartmentofHeilongjiangProvince，Harbin150030，China；3.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China；4.ChongqingAcademyofAnimalScience，Chongqing402460，China)

In order to further determine theC/EBPαbinding site ofL-FABPand analyze its role in the regulation ofL-FABPtranscription，theC/EBPαbinding site inL-FABPpromoter was effectively mutated using site-directed mutagenesis in the current study.The results showed that the expression ofL-FABPwas significantly repressed byC/EBPα，but theL-FABPpromoter activity was significantly promoted after the mutation ofC/EBPαbinding site.In a conclusion，the expression ofL-FABPwas significantly repressed byC/EBPα，andC/EBPαprobably involved in the regulation ofL-FABPexpression through this binding site.These results will provide a foundation for further research on the regulatory mechanism and function of chickenC/EBPαonL-FABPgene.

chicken；L-FABPgene；promoter；site-directed mutagenesis；C/EBPαgene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.003

2014-11-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(30972087)；博士后研究人員落戶黑龍江科研啟動(dòng)資助金(LBH-Q08131)；重慶市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才培育工程(14401)

賀 綦(1988-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：heqidongke@163.com

*通信作者：李 輝，博士，教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：lihui@neau.edu.cn；王啟貴，博士，教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：wangqigui@hotmail.com

S831.2

A

0366-6964(2015)09-1496-06