林建城，鄭云忠，閔志勇

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100)

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中國明對蝦蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究?

林建城，鄭云忠，閔志勇

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100)

以中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)肝胰臟為材料，通過硫酸銨沉淀分級分離、Sephadex G-100和DEAE-32柱層析純化，經(jīng)PAGE獲得蛋白酶，該酶的比活力為96.752 U/mg。SDS-PAGE顯示一譜帶，測得酶亞基分子量為36.3 kDa，凝膠層析法測得酶分子量為100.9 kDa，推斷該蛋白酶由3個相同亞基組成，等電聚焦電泳法測得酶的等電點pI為9.65。以酪蛋白為底物，研究蛋白酶催化反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明：蛋白酶的最適pH、最適溫度、Km和Vmax分別為8.0、65 ℃、4.578 mg/mL和0.273 U/min；酶在pH為5.0～10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，在20～45 ℃之間具有較好的熱穩(wěn)定性，在50 ℃以上熱穩(wěn)定性迅速下降。Mg2+對酶活力沒有影響，Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+和Hg2+對酶有不同程度的抑制作用，其中Hg2+的抑制作用最強(qiáng)，10 mmol/L Hg2+可使酶活力完全喪失，而Fe2+對酶有激活作用。EDTA對酶活力沒有影響，推斷該蛋白酶為非金屬蛋白酶。

中國明對蝦；蛋白酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對蝦餌料種類繁多，了解對蝦對餌料的消化能力，即進(jìn)行對蝦消化酶的種類、酶活力大小及其活力調(diào)控的研究是至關(guān)重要的。蛋白酶是對蝦的主要消化酶，Guizani等[1]已從克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)肝胰臟，而Fernández Gimenez等[2]從野生紅蝦(Pleoticusmuelleri)的肝胰臟中分別提取到蛋白酶，并闡明其消化生理；楊文鴿等[7]從中華管鞭蝦(Solenoceracrassicornis)、潘濱等[8]從凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、杭虞杰等[9]則從南極磷蝦(Antarctickrill)等不同的消化器官中分離純化出蛋白酶，并闡明其催化特性，這些研究對蝦的健康養(yǎng)殖起到重要的指導(dǎo)作用。此外，Cao等[10]還借助蝦蛋白酶等對組織自溶作用，較好地回收了蝦頭中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，揭示了蝦蛋白酶的生理過程，有助于開發(fā)利用蝦內(nèi)源蛋白酶。

中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)也稱“中國對蝦”，經(jīng)濟(jì)價值高，是中國沿海的主要養(yǎng)殖蝦類，其肝胰臟有較高的蛋白酶活力[11]。但對中國明對蝦蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)特性的研究國內(nèi)外尚未見詳細(xì)報道。本試驗擬從中國明對蝦肝胰臟中提取分離蛋白酶，對其酶學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為對蝦蛋白酶活力調(diào)控的研究奠定基礎(chǔ)，為開發(fā)海洋生物蛋白酶、綜合利用蝦資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Sephadex G-100是Pharmacia產(chǎn)品，DEAE-32系Whatman分裝，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，電泳使用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量為19～117 kDa，凝膠層析法測定蛋白酶分子量使用的λ球蛋白(GBL 150 kDa)、牛白蛋白(BSA 67.0 kDa)、纖維素酶(CLL 52.0 kDa)、雞卵蛋白(OA 45.0 kDa)和辣根過氧化物酶(HRP 44.0 kDa)均為天根生化科技有限公司出品，DH020-1載體兩性電解質(zhì)出自DGSC，酪氨酸等其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 酶的分離純化 選取(15.0±1.0) cm大小活的健康中國明對蝦于冰塊上解剖，去除腸道、胃和其它附著物，取出肝胰臟作為提酶原料，樣品按照1∶3(W∶V)加入預(yù)冷0.01 mol/LTris-HCl緩沖液(pH=7.5)，高速搗碎勻漿1 min，4 ℃下抽提4 h以上，冷凍離心(20 000×g)30 min，取上清液。依次采用30%、60%飽和度硫酸銨分級分離酶蛋白，收集的沉淀物用0.01 mol/LTris-HCl(pH=7.5)緩沖液透析，冷凍離心(20 000×g))30 min，收集沉淀得粗酶制劑。進(jìn)一步經(jīng)過Sephadex G-100分子篩凝膠柱層析(柱規(guī)格為2.6×60 cm)和DEAE-32離子交換柱層析(柱規(guī)格1.8cm×30cm)純化。Sephadex G-100柱層析的洗脫液為內(nèi)含0.2 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)，部分收集，每管4 mL，流速0.4 mL/min；DEAE-32柱層析用含0～1.0 mol/L NaCl的0.03 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.6)進(jìn)行梯度洗脫，收集酶活力峰，進(jìn)行純度鑒定。

1.2.2 蛋白酶活力的測定 蛋白酶活力測定參照施特爾馬赫[12]方法，略加修改如下：2 mL的測活體系中包含0.5 mL的2%酪蛋白底物(緩沖液配制)，1.45mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)，置37 ℃水浴恒溫10 min后，加入50 μL酶液，反應(yīng)20 min，后加入3 mL 5%三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，1 000 r/min離心10 min，取上清液測定其A275 nm。以先加5%TCA，再加酶液為空白對照。

1個酶活力單位(U)定義為：在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmoL酪氨酸所需要的酶量。比活力定義為每毫克酶蛋白中所具有的酶活力單位數(shù)(U)。

1.2.3 蛋白濃度測定 采用Bradford[13]方法進(jìn)行，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；用紫外吸收A280 nm表示分離純化過程蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 酶純度鑒定 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢定，確定酶的純度。

1.2.5 酶蛋白分子量的測定 采用SDS-PAGE測定其純度與相對分子量，分離膠濃度是10.0%，濃縮膠濃度為3.0%，使用考馬斯亮藍(lán)R250染色。進(jìn)一步采用Sephadex G-100凝膠層析法測定蛋白酶的分子量[14]，選用5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)(lgMw)為橫坐標(biāo)，各自洗脫體積Ve(mL)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)待測酶的洗脫體積，求得其分子量。

1.2.6 等電點的測定 采用等電點聚焦電泳法[15]，兩性電解質(zhì)載體pH為3.5～10，4 ℃下150 V聚焦4h，以10%三氯乙酸固定。

2 結(jié)果

2.1 中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的分離純化

中國明對蝦肝胰臟經(jīng)勻漿、抽提、30%和60%飽和度硫酸銨分級分離、透析離心后得到蛋白酶粗酶制劑。進(jìn)一步經(jīng)過Sephadex G-100分子篩柱層析分離純化(見圖1)，出現(xiàn)3個蛋白質(zhì)吸收峰，但只有第二個蛋白峰周圍具有蛋白酶活性，收集酶活力峰；再經(jīng)DEAE-32纖維素離子交換柱層析分離(見圖2)，從NaCl洗脫曲線分析，在0.25 mol/L NaCl下蛋白酶開始洗脫出來。各步分離純化結(jié)果見表1，最終得到純化倍數(shù)22.11，比活力為96.752 U/mg的蛋白酶制劑，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定為單一蛋白質(zhì)成分(見圖3a)，說明該酶制劑已達(dá)電泳純。

圖1 中國明對蝦肝胰臟蛋白酶經(jīng)Sephadex G-100層析的洗脫曲線

圖2 中國明對蝦肝胰臟蛋白酶經(jīng)DEAE-32層析的洗脫曲線

2.2 蛋白酶純度鑒定和分子量測定

純化后的蛋白酶制劑進(jìn)一步經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(見圖3b)，結(jié)果表明：酶制劑中雜蛋白已被除去，獲得了單一純的蛋白酶制劑。從SDS-PAGE電泳圖譜求各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對遷移率Rf，以6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的Rf對相應(yīng)分子量的對數(shù)lgMw作圖(見圖4)，回歸一直線，直線方程為：y=-1.547x+5.187，根據(jù)蛋白酶的Rf，求得蛋白酶亞基分子量為36.3 kDa。

用Sephadex G-100凝膠層析法測定了蛋白酶的分子量，以5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積(Ve)對蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)(lgMw)作圖(見圖5)，得直線方程為：y=-0.012x+6.016；蛋白酶通過凝膠柱層析后的洗脫體積Ve為84 mL，求得蛋白酶的分子量為100.9 kDa。

2.3 蛋白酶等電點的測定

用等電聚焦電泳法測定了蛋白酶的等電點，以凝膠長度L對pH作圖(見圖6)，得直線方程為：y=1.08x+2.58。試驗表明：蛋白酶的電泳條帶距離正極為6.55 cm，求得中國明對蝦蛋白酶等電點pI=9.65。

表1 中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的分離純化

圖3 蛋白酶經(jīng)PAGE(a)及SDS-PAGE(b)圖譜

2.4 蛋白酶最適pH與酸堿穩(wěn)定性

考察了蛋白酶在不同pH下的酶活力大小，(見圖7a)，蛋白酶催化酪蛋白水解的最適pH為8.0，偏弱堿性；進(jìn)一步研究了4 ℃下蛋白酶經(jīng)不同pH的Tris-HCl緩沖液處理1 h后的剩余酶活力(%)，分析酶的酸堿穩(wěn)定性范圍(見圖7b)。結(jié)果顯示：蛋白酶在pH=5.0～10.0時相對穩(wěn)定，經(jīng)pH=11.6緩沖液處理后酶活力還剩78.5%，而pH<5.0時處理酶失活加速，說明該蛋白酶對酸敏感，較耐堿，結(jié)合其是偏堿性的(pI=9.65)，可推測中國明對蝦蛋白酶為堿性蛋白酶。

圖4 SDS-PAGE測定蛋白酶亞基分子量

2.5 蛋白酶最適溫度與溫度穩(wěn)定性

研究了溫度對蛋白酶酶活力的影響(見圖8a)。結(jié)果顯示：溫度對蛋白酶活力的影響曲線呈典型的鐘罩型，酶催化酪蛋白水解的最適溫度為65 ℃，65 ℃以上隨溫度升高剩余酶活力(%)不斷下降，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃，酶活力只剩15.9%；進(jìn)一步研究蛋白酶在不同溫度下熱處理1 h后的剩余酶活力(見圖8b)，表明酶只在20～45 ℃之間具有較好的熱穩(wěn)定性；55 ℃下處理1 h酶剩余活力為36.5%，80 ℃下處理1 h酶接近失活，說明中國明對蝦蛋白酶對熱變化敏感。

圖5 Sephadex G-100柱層析測定中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的分子量

圖6 凝膠等電聚焦法測定中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的等電點

2.6 蛋白酶水解底物酪蛋白的動力學(xué)參數(shù)測定

以酪蛋白為底物，在1.0～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，測定不同底物濃度下蛋白酶的酶活力。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法(見圖9)，得到1條直線，直線方程為：y=16.750x+3.659。求得Km為4.578 mg/mL，Vmax為0.273 U/min。

2.7 金屬離子對蛋白酶活力的影響

研究了9種金屬離子對蛋白酶活力的影響(見表2)。結(jié)果表明：100 mmol/L的Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Co2+和Zn2+可分別使蛋白酶活力喪失22.69%、30.70%、59.90%、71.07%、82.33%和96.88%，Mg2+對酶活力基本沒有影響，F(xiàn)e2+對蛋白酶活力則表現(xiàn)為較強(qiáng)的激活作用，5 mmol/L Fe2+可使酶活力提高155.68%；Hg2+對蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，10 mmol/L Hg2+可使蛋白酶活力完全喪失。研究了金屬蛋白酶類抑制劑EDTA在0～10 mol/L濃度范圍內(nèi)對蛋白酶的影響，結(jié)果表明：EDTA對蛋白酶活力沒有影響，說明中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的活性中心不含有金屬離子，為非金屬蛋白酶。

(a:最適pH;b:酸堿穩(wěn)定性。a: optimum pH； b: pH stability.)圖7 pH對中國明對蝦肝胰臟蛋白酶活力的影響

(a：最適溫度;b：熱穩(wěn)定性。a: optimum temperature； b: temperature stability.)圖8 溫度對中國明對蝦肝胰臟蛋白酶活力的影響

圖9 中國明對蝦肝胰臟蛋白酶催化酪蛋白水解的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖

3 討論

3.1 中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的分離純化

蝦的肝胰臟、腸道等消化器官中含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等多種蛋白酶，但通過多步驟分離純化后獲得的蛋白酶組分往往很少。本試驗通過多級分離，2次柱層析色譜均只有1個酶活力峰，得到比活力為96.752 U/mL的純酶。潘濱等[8]在從凡納濱對蝦蝦頭分離純化蛋白酶中，經(jīng)凝膠層析和離子交換層析分離均只得到1個蛋白酶活力峰。而杭虞杰等[9]從南極磷蝦(Antarctickrill)中分離純化蛋白酶，先后經(jīng)陰離子交換層析和凝膠層析，最后也只得到1個酶活力峰，SDS-PAGE電泳顯示1條譜帶；Guizani等[1]在分離純化克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)肝胰臟類胰蛋白酶時采用30%～70%的飽和硫酸銨分級分離，經(jīng)Sephadex G-100和DEAE-纖維素2柱層析純化，得到1個蛋白酶活力峰經(jīng)SDS-PAGE電泳只顯示1條蛋白譜帶，與本試驗結(jié)果相似。

表2 金屬離子對中國明對蝦肝胰臟蛋白酶活力的影響

3.2 中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的相對分子量

不同蝦類蛋白酶亞基分子量不同。中華管鞭蝦[7]蛋白酶分子量為24.5 kDa，酶蛋白只由1個亞基組成；Johnston等[16]從東方扁蝦(Thenusorientalis)消化腺中分離到亞基分子量為35 kDa的胰蛋白酶，而南極磷蝦[9]蛋白酶亞基分子量為28.0 kDa；野生紅蝦(Pleoticusmuelleri)[2]在蝦蛻皮期間肝胰臟出現(xiàn)12種分子量(16.6～53.1 kDa)不等的蛋白酶亞基，在蛻皮后還分離到1個大分子量(65.3 kDa)的蛋白亞基，這些蛋白亞基都具有胰蛋白酶性質(zhì)。而本試驗中國明對蝦蛋白酶亞基分子量為36.3 kDa，根據(jù)凝膠層析法測定的蛋白酶相對分子量(100.9 kDa)，推斷該酶是由3個相同亞基組成。酶分子量相對較大，這應(yīng)該是蝦長期適應(yīng)生存的環(huán)境所形成的種屬特性。

3.3 pH對中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的影響

pH對蝦類蛋白酶影響的試驗結(jié)果表明：中國明對蝦蛋白酶最適反應(yīng)pH為8.0，酸堿穩(wěn)定性范圍寬，在pH為5.0～10.0內(nèi)處理1 h酶活力還維持在84%以上，pI=9.65。這與南極磷蝦[9]蛋白酶的最適pH相同，而中國龍蝦(Panulirusstimpsoni)[17]肝胰臟類胰蛋白酶最適pH為8.8，這些蝦蛋白酶的最適pH值均偏堿性，一般胰蛋白酶反應(yīng)最適合pH在7.0～9.0[18]。南極磷蝦[9]蛋白酶在pH為7.0～9.5范圍內(nèi)穩(wěn)定，利用粗酶液研究的中國對蝦(Penaeuschinensis)[19]蛋白酶也在pH為7.0～10.0內(nèi)穩(wěn)定。中國明對蝦適宜在pH為7.8～9.3的水體中生長[20]，也在蝦蛋白酶的酸堿穩(wěn)定范圍內(nèi)。

此外，Sainz等[21]從凡納對蝦(Penaeusvannamei)消化腺中分離到3種類胰蛋白酶組分，pI分別為3.0、3.5和4.5；克氏原鰲蝦[1]肝臟類胰蛋白酶的pI=3.0；而中國明對蝦蛋白酶pI偏堿性，因此推斷中國明對蝦蛋白酶是1種堿性蛋白酶。這與孔繁東等[19]研究的中國對蝦消化腺蛋白酶也是1種堿性蛋白酶的結(jié)果一致，可能是中國明對蝦適宜在偏堿性的水體中生長的原因之一。根據(jù)本試驗酶活力檢測方法以及從分離到蛋白酶的最適pH和等電點分析，試驗獲得的蛋白酶可能是1種類胰蛋白酶。

3.4 溫度對中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的影響

不同蝦類蛋白酶的最適溫度不同。中國明對蝦蛋白酶的最適溫度為65 ℃，與斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)(A,B,C 3組分)(65 ℃)相同[22]，大于南極磷蝦蛋白酶(50 ℃)和南美白對蝦(Penaeusvannamei)絲氨酸蛋白酶的最適溫度(40 ℃)[9,23]。試驗還表明：55 ℃下處理1 h后中國明對蝦蛋白酶活力會喪失63.5%，而凡納濱對蝦蛋白酶在60 ℃下處理1 h，酶活性僅殘留4.7%[8]，均呈現(xiàn)對熱的不穩(wěn)定性中。然而，中華管鞭蝦蛋白酶在60 ℃放置1 h后酶活性仍保持在60%以上[7]，說明不同蝦類蛋白酶的熱穩(wěn)定性不同。中國明對蝦生長的適宜水溫為18～30℃，耐高溫能力差[20]，而對蝦肝胰臟蛋白酶較適溫度并不在此范圍內(nèi)，說明中國明對蝦蛋白酶常在低于最適溫度值下進(jìn)行作用的,具有低溫適應(yīng)性，水溫高時酶活性也高，因此在不同水溫下應(yīng)根據(jù)消化酶的活性來決定餌料成分的配比及投餌量。

3.5 金屬離子對中國明對蝦肝胰臟蛋白酶的影響

本試驗研究表明：Ca2+等7種金屬離子對中國明對蝦蛋白酶有不同程度的抑制作用，Hg2+抑制作用最強(qiáng)，Mg2+對酶活力沒有影響，F(xiàn)e2+則有較大的激活作用。這些金屬離子對不同蝦類蛋白酶的效應(yīng)存在差異，Mg2+，Zn2+，Cu2+和Hg2+對克氏原鰲蝦[1]肝胰臟類胰蛋白酶有不同程度的抑制作用；而Ca2+對凡納濱對蝦[8]蛋白酶有激活作用，F(xiàn)e2+、Ba2+和Zn2+表現(xiàn)為較強(qiáng)抑制作用；Mg2+對中華管鞭蝦蛋白酶有激活作用[7]，但Ca2+、Ba2+和Fe2+對其影響不大。說明蝦生活的水環(huán)境中金屬離子或在配合飼料中添加的礦物質(zhì)均可能對蛋白酶活力產(chǎn)生影響，在配合飼料中添加礦物質(zhì)時要注意控制添加量，以免使中國明對蝦蛋白酶的活性降低，影響對蛋白質(zhì)的消化吸收。目前對對蝦配合飼料中微量元素的添加量還沒有專門系統(tǒng)的研究，具體的添加量應(yīng)根據(jù)飼養(yǎng)試驗來進(jìn)一步確定。

EDTA是金屬蛋白酶類的抑制劑，凡納濱對蝦[8]和中華管鞭蝦[7]消化腺蛋白酶均受到EDTA的抑制，為金屬蛋白酶類；但對南極磷蝦蛋白酶基本沒有影響[9]，本研究表明EDTA對中國明對蝦蛋白酶活力沒有影響，可推斷該酶為非金屬蛋白酶。

總之，蝦蛋白酶活性的發(fā)揮還是受到蝦體內(nèi)外諸多因素制約，蝦生存的水體溫度、環(huán)境pH、體內(nèi)外離子濃度及飼料中礦物質(zhì)成分等發(fā)生改變，均會影響著蝦消化道蛋白酶的活性。

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責(zé)任編輯 高 蓓

Isolation,Purification and Properties of Protease fromFenneropenaeuschinensis

LIN Jian-Cheng, ZHENG Yun-Zhong, MIN Zhi-Yong

(School of Environment & Biological Engineering, Putian University, Putian 351100, China)

The protease was purified from the hepatopancreas ofFenneropenaeuschinensisby ammonium sulfate fractionation, then chromatographed on Sephadex G-100 followed by DEAE-cellulose(DE-32) column. The purified enzyme determined to be homogeneous by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and SDS-PAGE. The specific activity of the purified enzyme was 96.752 U·mg-1. Enzyme molecular weight was determined to be 100.9 kDa; it contained three subunits of the same mass (36.3 kDa). The pI value was calculated to be 9.65 by isoelectric focusing. The optimum pH and optimum temperature of the enzyme for the hydrolysis of casein(enzyme substrate) were determined to be pH 8.0 and 65 ℃, respectively. TheKmandVmvalues were determined to be 4.578 mg/mL and 0.273 U/min by plot of Lineweaver-Burk, respectively. The stability of the enzyme was investigated, and the results showed that the enzyme was stable in a pH range from 5.0 to 10.0 and at temperatures<45 ℃. The stability of enzyme dropped rapidly at temperatures>50 ℃. The effects of metal ions on the enzyme were also studied. Mg2+had no influence on enzyme activity. Fe2+activated the enzyme, while Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+and Hg2+showed various degrees of inhibitory effects on the enzyme. Hg2+inhibited the enzyme most strongly, when its concentration reached 10 mmol·L-1, enzyme activity completely ceased. EDTA had no influence on the enzyme indicating the protease was nonmetallic enzyme.

Fenneropenaeuschinensis; protease; isolation and purification; enzyme properties

福建省高校服務(wù)海西重點建設(shè)項目(2008HX02)；福建省區(qū)域科技重大項目(2009N3002)資助

2014-03-26；

2014-05-21

林建城(1966-)，男，教授，從事海洋生物酶學(xué)的研究工作。E-mail: ptljc660402@sina.com

Q556.1

A

1672-5174(2015)06-057-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140075