徐小龍，茍文龍，王 程，袁雪凌，王 玉，彭 江，盧世璧，郭全義，汪愛媛，許文靜，孟昊業(yè)，劉舒云

1解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853；2第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院 骨科，重慶 400042

基礎研究論著

低濃度唑來膦酸對成骨細胞和破骨細胞影響的體外實驗

徐小龍1，茍文龍2，王 程1，袁雪凌1，王 玉1，彭 江1，盧世璧1，郭全義1，汪愛媛1，許文靜1，孟昊業(yè)1，劉舒云1

1解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853；2第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院 骨科，重慶 400042

目的觀察低濃度(10-6mol/L)唑來膦酸(zoledronate acid，ZA)對體外大鼠破骨細胞及成骨細胞的影響。方法體外分別培養(yǎng)大鼠來源的成骨細胞和破骨細胞，將兩種細胞各分為兩組：空白對照組及低濃度(10-6mol/L)ZA組。應用抗酒石酸酸性磷酸酶染色、圖像分析計算骨吸收陷窩面積，檢測破骨細胞形態(tài)及骨吸收情況。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色、四甲基偶氮唑鹽比色法了解成骨細胞的形態(tài)及增殖情況。結(jié)果培養(yǎng)1周后破骨細胞具有典型的形態(tài)特征，并在骨片上形成了吸收陷窩；ZA組與對照組相比，破骨細胞數(shù)量及生成吸收陷窩的數(shù)目和面積減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。成骨細胞有典型的梭形、ALP染色陽性特征，培養(yǎng)至第7天ZA組成骨細胞光吸收值(3.37±0.11)高于對照組(2.87±0.12)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論低濃度(10-6mol/L)的ZA能夠抑制破骨細胞的增殖和活性，促進成骨細胞的增殖，選擇恰當給藥方式和劑量能夠在抑制破骨的同時促進成骨。

唑來膦酸；成骨細胞；破骨細胞

唑來膦酸(zoledronateacid，ZA)是目前最強效的含氮雙磷酸鹽，現(xiàn)已廣泛用于治療以過度骨吸收為特征的疾病，包括骨質(zhì)疏松、骨髓瘤、骨轉(zhuǎn)移瘤、Perthes病等。目前，對ZA的研究大多是針對破骨細胞進行的，其對破骨細胞的抑制作用也得到了廣泛的認同。但越來越多的研究證明，雙膦酸鹽具備促進成骨細胞增殖和分化的能力，但這種作用具有濃度依賴性：即10-9～ 10-6mol/L的較低濃度雙膦酸鹽可以促進成骨細胞的生長和分化，但是＞10-5mol/L時就會有抑制作用[1-3]。然而這種作用尚存在爭議。本文在外培養(yǎng)大鼠的成骨細胞和破骨細胞，研究強效的含氮雙磷酸鹽ZA對大鼠來源的成骨細胞和破骨細胞的影響，以探討及作用機制。

材料和方法

1試劑與儀器 唑來膦酸、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自Sigma公司；核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κβ ligand，RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)購自Abcam公司；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑盒購自Sigma公司；CO2培養(yǎng)箱購自Hereus公司；磨片機購自MetaServ?Buehler公司；酶標儀購自BIO-RAD公司。

2藥物配制及分組 唑來膦酸粉劑(100 mg/瓶，Sigma公司)用磷酸鹽液溶解，滴加0.1 mol/L NaOH，pH值滴定至7.4，儲備液濃度為10-2mol/L，封裝后，Gamma射線輻照滅菌，-20℃冰箱保存。用前加入培養(yǎng)液稀釋至所要求的實驗終濃度10-6mol/L。

3骨片的制備與處理制備骨片 用以計算破骨細胞骨吸收陷窩面積，研究其破骨作用。取新鮮牛股骨，切割至厚度50 μm的薄切片，再分別用磨片機磨成10 μm厚，5 mm×5 mm大小的骨片，超聲清洗后，Gamma射線輻照滅菌，4℃冰箱保存。

4破骨細胞及成骨細胞的培養(yǎng) 從解放軍總醫(yī)院實驗動物中心購買10只2周齡雄性SD大鼠。破骨細胞培養(yǎng)：在CO2室處死后，于無菌條件下將大鼠的肱骨及股骨剝離至無菌培養(yǎng)皿中，去除周圍組織及干骺端后，用1 mm注射器吸取無菌PBS沖洗髓腔，將混合液于800 r/min，離心5 min，用含10 ng/ml M-CSF的DMEM培養(yǎng)24 h后，計數(shù)，并用含有100 ng/ml M-CSF和50 ng/ml RANKL的DMEM重懸，接種于12孔板及含有骨片的六孔板中，每3 d更換1次液體。成骨細胞培養(yǎng)：無菌條件下取其顱蓋骨，剔除周圍組織，加入0.25%胰酶，37℃消化30 min，后用PBS反復沖洗3次后，加入0.1%的Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫消化1 h，終止反應后，用DMEM將其重懸，計數(shù)并接種于培養(yǎng)瓶中，每3 d更換1次培養(yǎng)液。

5實驗分組 1)破骨細胞接種在12孔板及6孔板，每組各10孔，實驗組給予含有10-6mol/L ZA的DMEM培養(yǎng)液，對照組加入含等量磷酸酸鹽溶液的DMEM培養(yǎng)液，每3 d換1次液體。培養(yǎng)5 d后TRAP染色觀察破骨細胞的形態(tài)并進行計數(shù)，7 d后甲苯胺藍染色觀察骨陷窩，并進行骨陷窩計數(shù)和面積分析。2)成骨細胞在培養(yǎng)至第3代接種于12孔板和96孔板后，實驗組與對照組分別給予含有10-6mol/L ZA的DMEM培養(yǎng)液和等量磷酸鹽溶液的DMEM培養(yǎng)液，每3 d換1次液體。成骨細胞接種于96孔板后中行MTT檢測增殖情況，在12孔板培養(yǎng)7 d后，行ALP染色觀察成骨細胞形態(tài)。

6MTT檢測10-6mol/L ZA作用下成骨細胞的生長將傳至第3代的成骨細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl細胞懸液(5×103/孔)，每板分3組，每組5個復孔，共4板。37℃，5% CO2箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別在各組中加入含等量磷酸鹽溶液DMEM培養(yǎng)液，含10-6mol/L ZA培養(yǎng)液及二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液各100 μl。分別于加藥后1 d、3 d、5 d、7 d取1板進行MTT檢測，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min，酶標儀在490 nm處檢測各組的光吸收(optical density，OD)值，并以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制生長曲線。

7統(tǒng)計學處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)用表示，所有定量數(shù)據(jù)資料均經(jīng)過正態(tài)性檢驗，定量數(shù)據(jù)的組間差異性檢驗采用成組設計的t檢驗或秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1成破骨細胞形態(tài)的觀察和鑒定 成功誘導培養(yǎng)出具有多核的、細胞質(zhì)豐富的、TRAP陽性的破骨細胞，以及具有飽滿、梭形、細胞質(zhì)內(nèi)有顆粒狀沉淀的成骨細胞(圖1)。

2ZA對破骨細胞生成及骨吸收功能的影響 對TRAP陽性細胞進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，ZA組破骨細胞數(shù)(13.9±1.7)低于空白對照組(23.7±2.5)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖2，P＜0.05)。骨吸收陷窩為橢圓形或梅花形淡藍色陷窩(圖3)；ZA組骨吸收陷窩數(shù)目及面積低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 骨吸收陷窩及骨吸收陷窩面積的比較Tab. 1 Quantitative analysis of the number of osteoclastic bone resorbing lacunae and the area of osteoclastic bone resorbing lacunae (, n=10)

表1 骨吸收陷窩及骨吸收陷窩面積的比較Tab. 1 Quantitative analysis of the number of osteoclastic bone resorbing lacunae and the area of osteoclastic bone resorbing lacunae (, n=10)

aP＜0.05, vs control group

Control group (n=10)ZA group (n=10)tP Number of bone resorption lacunae (n)29.44±13.117.06±1.7a2.9640.008 3 Area of bone resorption lacunae (μm2)493.74±53.1322.74±63.6a6.5270.000 0

3ZA對成骨細胞的影響 與對照組相比，ZA組成骨細胞吸光度隨時間延長而逐漸增加，至第7天時，實驗組OD值(3.37±0.11)較對照組(2.87±0.12)有統(tǒng)計學差異(P＜0.05，圖4)。

圖 1 成破骨細胞特殊染色 A： 破骨細胞TRAP染色(IHC×100)； B： 成骨細胞 ALP染色(IHC×100)圖 2 甲苯胺藍染色顯示骨吸收陷窩(IHC×200)Fig. 1 Special staining of osteoblasts and osteoclasts A： TRAP staining (IHC×100); B： ALP staining (IHC×100)Fig. 2 Toluidine blue staining showing bone resorption lacunae (IHC×200)

圖 3 兩組破骨細胞計數(shù)比較 (aP＜0.05)Fig. 3 Comparative analysis of the number of osteoclasts between two groups (aP＜0.05)

圖 4 兩組成骨細胞增殖曲線比較Fig. 4 Comparative analysis of the proliferation curves of osteoblasts between two groups

討 論

雙膦酸鹽對骨的高選擇性使得他們能有效地作用于與骨緊密結(jié)合的破骨細胞[4-5]。大量研究已經(jīng)表明，雙膦酸鹽可能會通過各種方式影響破骨細胞的功能，包括破骨細胞的招募，分化和骨吸收活性，并且可能會導致破骨細胞的凋亡[6]。ZA是強效的含氮雙磷酸鹽，是可在細胞內(nèi)抑制破骨細胞內(nèi)甲羥戊酸通路中的關鍵酶，使得維持破骨細胞功能的小GTP酶合成減少，影響破骨細胞的分化和生長[7-8]。本研究表明，在低濃度(10-6mol/L) ZA的作用下，離體培養(yǎng)的破骨細胞的數(shù)量、骨吸收陷窩個數(shù)及骨吸收陷窩面積與對照組相比減少，差異有統(tǒng)計學意義。證明ZA不但能抑制破骨細胞的增殖，還能有效地抑制破骨細胞的功能，從多個方面證明ZA對于破骨細胞的抑制作用，這與Sato和Grasser[9]、Weinstein等[10]及Kimachi等[11]的研究結(jié)果類似。

雙膦酸鹽對破骨細胞的作用已被廣泛認同，而其對骨細胞和成骨細胞的作用仍存在爭議。有研究表明，雙膦酸鹽可通過連接蛋白43(Cx43蛋白)形成的通道抑制成骨細胞的凋亡[12]。Cx43蛋白是一種表達在成骨細胞和骨細胞的連接蛋白，Cx43蛋白半通道的打開，激活了“細胞外信號調(diào)節(jié)激酶”，從而啟動激活了p90RSK的激酶的順序磷酸化，并最終作用于BAD和C/EBPβ，從而抑制細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度(10-6mol/L)的ZA能對離體培養(yǎng)的成骨細胞沒有毒性，并且能起到促進其增殖的作用，這與Jeong等[13]、Ho[14]的研究相類似。

本研究為ZA的細胞學作用機制提供了依據(jù)。本實驗的局限在于，在離體培養(yǎng)無法準確模擬體內(nèi)釋放ZA的過程和劑量，所以還需進一步的動物實驗進行驗證。

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Effects of low concentration of zoledronic acid on osteoclasts and osteoblasts in vitro

XU Xiaolong1, GOU Wenlong2, WANG Cheng1, YUAN Xueling1, WANG Yu1, PENG Jiang1, LU Shibi1, GUO Quanyi1, WANG Aiyuan1, XU Wenjing1, MENG Haoye1, LIU Shuyun1

1Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Orthopedics, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China

PENG Jiang. Email: pengjiang301@126.com

ObjectiveTo explore the effects of low concentration (10-6mol/L) of zoledronic acid (ZA) on osteoclasts and osteoblasts.MethodsOsteoclasts and osteoblasts were obtained from neonatal rats and cultured in vitro, and they were divided into control group and ZA group. TRAP staining and image analysis were used to detect the proliferation and activity of osteoclasts. ALP staining and MTT were used to detect the morphological characteristics and proliferation of osteoblasts.ResultsAfter a week, osteoclasts showed typical morphological characteristics, and bone resorption lacunas were found in vitro. Compared with control group, the number of osteoclasts and lacunae (P＜0.05), and the area of lacunae (P＜0.05) in ZA group were significantly decreased. Osteoblasts showed typical fusiform and ALP showed positive staining characteristics. The optical density of osteoblasts was dramatically higher in ZA group (3.37±0.11) than control group (2.87±0.12) on day 7 after being cultured, and it had significant difference (P＜0.05).ConclusionThe low concentration (10-6mol/L) of ZA can inhibit proliferation and activity of osteoclasts and promote the proliferation of osteoblasts. Therefore, it is important to choose right administration and dose of ZA to enhance the osteogenesis and inhibit the bone resorption.

zoledronic acid; osteoblasts; osteoclasts

R 96

A

2095-5227(2015)04-0371-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.019

時間：2015-01-05 10:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150105.1039.001.html

2014-10-20

國家“863”計劃項目(2012AA020502)；全軍十二五重點項目(BWS11J025)；國家“973”重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目(2012 CB518106)

Supported by “863” Program of China(2012AA020502); Military Medical Research "12th Five-Year Plan"General Program of China(BWS11J025); National “973” Program for Basic Research of China(2012CB518106)

徐小龍，男，在讀碩士。研究方向：骨壞死。Email: Xu xiaolong0609@163.com

彭江，男，副主任醫(yī)師，教授，碩士生導師。Email: pe ngjiang301@126.com