李海霞， 徐久瑋， 蔡明歷， 曾漢來(lái)， 王學(xué)奎

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 作物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 武漢 430070)

小籃子法測(cè)定植物種子呼吸速率的方法改進(jìn)

李海霞， 徐久瑋， 蔡明歷， 曾漢來(lái)， 王學(xué)奎

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 作物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 武漢 430070)

利用CO2紅外氣體分析儀對(duì)測(cè)定植物種子CO2呼吸速率的小籃子法進(jìn)行了改進(jìn)。結(jié)果表明：改良小籃子法操作簡(jiǎn)便，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)變化，測(cè)定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高,變異系數(shù)較小，在一定程度上克服了傳統(tǒng)小籃子法的缺陷，使實(shí)驗(yàn)測(cè)定更具科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性，可用于本科生植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

呼吸速率；小籃子法；方法改進(jìn)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生的《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)》課程中開(kāi)設(shè)了利用小籃子法(又稱廣口瓶法、堿吸收法、堿中和法、化學(xué)滴定法)對(duì)植物種子呼吸速率進(jìn)行測(cè)定的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

測(cè)定種子呼吸速率的方法有多種，其中常用的有微量定容測(cè)壓法[1-2]和小籃子法[3-9]。微量定容測(cè)壓法測(cè)定種子呼吸速率的原理是在恒溫和恒體積的條件下，用壓力變化測(cè)定O2的消耗量，一般利用的儀器是微量呼吸檢壓計(jì)[10]。但此法的缺點(diǎn)是所用樣品體積小, 取樣要求精細(xì), 過(guò)程較繁瑣，若操作技術(shù)欠熟練, 誤差較大。小籃子法測(cè)定種子呼吸速率的原理是用堿液吸收在單位時(shí)間內(nèi)呼吸產(chǎn)生的CO2，再利用酸堿中和滴定原理滴定剩余的堿液，由空白和樣品二者消耗的酸溶液之差即可計(jì)算出呼吸過(guò)程中釋放的CO2的量[10]。由于只需要簡(jiǎn)單裝置，因而小籃子法適用性較廣，但其缺點(diǎn)是在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中難以避免會(huì)有外界CO2的侵入和干擾，人為和客觀影響因素較多，致使測(cè)定結(jié)果精確度較差。

隨著中國(guó)科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出價(jià)格適中、適合教學(xué)的IRGA。為克服傳統(tǒng)小籃子法測(cè)定植物種子呼吸速率的缺陷，本實(shí)驗(yàn)利用IRGA對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)測(cè)定的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性，以期利用先進(jìn)儀器設(shè)備提升本科生植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選取適量油菜、小麥和玉米種子用清水分別浸種12 h、24 h和24 h(中間換水1次)，將浸泡好的種子平鋪在瓷盤(pán)中，用濕毛巾覆蓋催芽，以剛露芽為宜。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 傳統(tǒng)小籃子法測(cè)定種子呼吸速率

參照王學(xué)奎[10]的方法，設(shè)計(jì)2.5 g、5.0 g和10.0 g 3個(gè)不同種子用量的處理，反應(yīng)時(shí)間分別為10 min、20 min和30 min，每個(gè)處理重復(fù)3～5次。

狀態(tài)3 在iP(t)反向的時(shí)刻(即等效電流源iP(t)在零點(diǎn)的時(shí)刻),電路進(jìn)入狀態(tài)3。壓電電容CP上充滿了電,此時(shí)同步開(kāi)關(guān)閉合,并聯(lián)電感L和壓電電容CP形成L-C振蕩回路,將電容上的電壓在這一時(shí)刻進(jìn)行反向,待L-C振蕩結(jié)束后,CP上的電壓完成反向,同步開(kāi)關(guān)及時(shí)斷開(kāi)。至此,狀態(tài)3結(jié)束。

式中，Vo為空白滴定用去的草酸量(mL)，Vs為樣品滴定用去的草酸量(mL)，W為樣品鮮質(zhì)量(g)，t為測(cè)定時(shí)間(h)，1為每毫升1/44 mol/L的草酸相當(dāng)于1 mg CO2，44為CO2的相對(duì)分子量(g/mol)。

1.2.2 改良小籃子法測(cè)定種子呼吸速率

設(shè)計(jì)2.5 g、5.0 g和10.0 g 3個(gè)不同種子用量以及2 min、4 min、6 min、8 min和10 min 5個(gè)不同反應(yīng)時(shí)間的處理，對(duì)于10.0 g種子用量的處理再增加15 min和20 min 2個(gè)反應(yīng)時(shí)間。每個(gè)處理重復(fù)3～5次。利用CB-1101光合蒸騰作用測(cè)定系統(tǒng)(北京雅欣理儀科技有限公司)檢測(cè)種子呼吸產(chǎn)生的CO2量的變化，采取閉路測(cè)量方式進(jìn)行測(cè)定：將流量計(jì)與儀器面板上的“IN1”和“OUT1”接氣嘴相連，堿石灰管與“IN”和“OUT”接氣嘴相連，調(diào)節(jié)流量計(jì)流速為0.6 L/min，進(jìn)行CO2分析器調(diào)零；完成調(diào)零后取下堿石灰管，用一根硅膠管將“IN”和“OUT”接氣嘴相連，封閉此段氣路。把稱重后的測(cè)試材料放入一個(gè)500 mL廣口瓶?jī)?nèi)，瓶口用打有兩孔的橡皮塞塞緊，用硅膠管與儀器的“IN2”和“OUT2”接氣嘴相連，先平衡2 min，再開(kāi)始測(cè)量：先按“參/初”鍵，再按“測(cè)/終”鍵，記下CO2初始濃度值(μL/L)，到了測(cè)定時(shí)間(面板上有計(jì)時(shí)器)，記下CO2最終濃度值(μL/L)，測(cè)量結(jié)束時(shí)按下“完成”鍵，再重復(fù)上述步驟即可開(kāi)始下一次測(cè)量。在開(kāi)始測(cè)量之前，先向各接口處吹氣來(lái)檢查是否漏氣，以保證氣路的密封性良好。

式中，V為反應(yīng)體積(L)，ΔC為CO2濃度差值(μL/L，為CO2最終濃度值與初始濃度值的差值)，W為樣品鮮質(zhì)量(g)，t為測(cè)定時(shí)間(h)，24.5為25℃時(shí)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下的氣體摩爾體積(L/mol)。

1.2.3 溫度控制

將裝有材料的廣口瓶放在水浴鍋中保溫，以維持瓶?jī)?nèi)反應(yīng)溫度為25℃。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)和改良小籃子法測(cè)定油菜、小麥和玉米3種作物萌發(fā)種子的CO2呼吸速率，使用3個(gè)不同種子用量，每種處理各重復(fù)3～5次。傳統(tǒng)小籃子法測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表1，改良小籃子法測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表1 傳統(tǒng)小籃子法測(cè)定萌發(fā)種子的CO2呼吸速率

**—顯著性差異(P<0.01)。

由表1可看出，同一種作物不同種子用量的呼吸速率差異較大，且呼吸速率隨種子用量的增加而降低，3種作物的表現(xiàn)趨勢(shì)一致。統(tǒng)計(jì)分析表明傳統(tǒng)小籃子法的同種作物不同種子用量間的呼吸速率差異達(dá)到極顯著水平、變異系數(shù)也較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果精密度差、測(cè)定值偏高。

在改良小籃子法中，連好氣路后先平衡2 min，之后再隔2 min、4 min、6 min、8 min和10 min各測(cè)定1次，對(duì)于10.0 g種子用量的在15 min和20 min時(shí)再各測(cè)定1次。結(jié)果表明(表2)：同一作物不同反應(yīng)時(shí)間、不同種子用量間的ΔC比較穩(wěn)定且隨種子用量的增加而增大(資料未顯示)，呼吸速率比較穩(wěn)定。同種作物不同反應(yīng)時(shí)間的呼吸速率差異不顯著，小麥和玉米的2.5 g與5.0 g、10.0 g這2個(gè)種子用量間的呼吸速率差異達(dá)到顯著水平，而油菜不同種子用量間的呼吸速率無(wú)顯著性差異。在10.0 g種子用量的測(cè)定中(表3)，除玉米外，油菜和小麥的呼吸速率在反應(yīng)時(shí)間超過(guò)10 min后都隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且反應(yīng)時(shí)間為15 min和20 min的呼吸速率與其它反應(yīng)時(shí)間的差異達(dá)到顯著水平。這是因?yàn)閺V口瓶?jī)?nèi)氧氣量有限，隨著呼吸作用的進(jìn)行，氧氣量越來(lái)越少，導(dǎo)致不能滿足種子呼吸作用的需要。呼吸速率越小，氧氣可供應(yīng)的時(shí)間就越長(zhǎng)(如玉米)。此外，改良小籃子法測(cè)定的呼吸速率的變異系數(shù)較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更真實(shí)可靠。

表2 改良小籃子法測(cè)定萌發(fā)種子的CO2呼吸速率

*—小麥和玉米的2.5 g與5.0 g、10.0 g這兩個(gè)種子用量間的呼吸速率具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 改良小籃子法測(cè)定10.0 g萌發(fā)種子的CO2呼吸速率

*—顯著性差異(P<0.05)；**—顯著性差異(P<0.01)。

通過(guò)分析操作步驟及實(shí)驗(yàn)原理，對(duì)造成這兩種方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的影響因素進(jìn)行比較(表4)。由此可見(jiàn)，傳統(tǒng)小籃子法中Vo和Vs只有一個(gè)終點(diǎn)值，而沒(méi)有中間值，不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行情況，也不能根據(jù)測(cè)試材料的呼吸速率特性判斷適宜的反應(yīng)時(shí)間。傳統(tǒng)小籃子法易造成誤差的影響因素比改良小籃子法多，即便是規(guī)范操作，也難以避免會(huì)有外界CO2的侵入和干擾，且種子用量越少，受影響的程度越高。而改良小籃子法則在一定程度上克服了傳統(tǒng)方法的缺陷，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ΔC數(shù)據(jù)變化，便于確定測(cè)試材料的最佳測(cè)定時(shí)間，且在一定時(shí)間內(nèi)(10 min)測(cè)定呼吸速率都較穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)測(cè)定更緊密、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更可靠。

表4 兩種測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的影響因素比較

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定植物種子CO2呼吸速率的傳統(tǒng)小籃子法進(jìn)行了改進(jìn)，改良小籃子法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。采用改良小籃子法(500 mL體積)測(cè)定種子呼吸速率的最適種子用量為5 g左右，最適反應(yīng)時(shí)間控制在10 min之內(nèi)，對(duì)于呼吸速率較小的材料則可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。小籃子法的缺點(diǎn)是易受測(cè)試容器(廣口瓶)體積的限制而易將氧氣消耗完，若測(cè)試材料的呼吸速率較大，則可選用較大體積的廣口瓶或減少種子用量。此外，若受實(shí)驗(yàn)條件限制只能采用傳統(tǒng)小籃子法測(cè)定呼吸速率，建議種子用量要盡量大，可減少實(shí)驗(yàn)誤差。

改良小籃子法測(cè)定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異系數(shù)較傳統(tǒng)方法小，操作簡(jiǎn)便，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)變化，人為和客觀影響因素較少，準(zhǔn)確度較高，適用于大批量樣品的測(cè)定，這些優(yōu)點(diǎn)使其能更好地為科研服務(wù)并可應(yīng)用于植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐，有利于學(xué)生掌握新的技術(shù)手段，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

[1]黃真池，黃上志.不破壞種子活力測(cè)定方法研究Ⅱ種子活力與呼吸速率的關(guān)系[J].種子，1998，98(5)：3-5.

[2]王若蘭，嚴(yán) 佳，李燕羽，等. 不同條件下小麥呼吸速率變化的研究[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，30(4)：12-16.

[3]馮曉英，馬敏兵，陳慶富. 鑭對(duì)油菜種子萌發(fā)及其生理生化指標(biāo)的影響[J].種子，2010，29(8)：45-47.

[4]馬成倉(cāng)，李清芳，束良佐，等. 硅對(duì)玉米種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)作用機(jī)制初探[J].作物學(xué)報(bào)，2002，28(5)：665-669.

[5]梁海榮，邢侗姬，周小梅. 不同活力的小麥種子生理生化及其修復(fù)的研究[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版， 2010，33( 2) : 286-290.

[6]陸秀君，王妮妮，李天來(lái)，等.不同浸種和催芽處理對(duì)天女木蘭種子的催芽效果[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，36(5)：135-140.

[7]王 進(jìn)，張 勇，張有富，等.苦馬豆和披針葉黃華種子硬實(shí)特性與活力關(guān)系[J]. 植物生理學(xué)通訊，2010，46(12)：1219-1224.

[8]郁飛燕.干旱脅迫下硒對(duì)小麥種子萌發(fā)的影響[D]. 洛陽(yáng)：河南科技大學(xué)，2012.

[9]張景峰. 六種野生薔薇屬植物種子萌發(fā)及休眠的研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2009.

[10]王學(xué)奎.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù) [M]. (2版).北京：高等教育出版社，2006：165-166.

[11]Gillespie K M, Xu F, Richter K T, et al. Greater antioxidant and respiratory metabolism in field-grown soybean exposed to elevated O3under both ambient and elevated CO2[J]. Plant Cell Environ, 2012, 35(1):169-184.

[12]眭曉蕾， 張寶璽，張振賢，等. 不同品種辣椒幼苗光合特性及弱光耐受性的差異[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32(2)：222-227.

[13]Li X, Zhang G, Sun B, et al. Stimulated leaf dark respiration in tomato in an elevated carbon dioxide atmosphere [J]. Sci Rep, 2013(3):3433.

[14]王兆國(guó)，王傳寬．三種溫帶樹(shù)種葉片呼吸的時(shí)間動(dòng)態(tài)及其影響因子[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33( 5) : 1456-1464.

[15]徐佳佳. 晉西黃土區(qū)主要水土保持樹(shù)種光合和蒸騰特性研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2012.

Improved method for measuring respiratory rate of plant seeds using small-skep-method

LI Hai-xia, XU Jiu-wei, CAI Ming-li, ZENG Han-lai, WANG Xue-kui

(National Experimental Teaching Demonstration Centre of Crop Science, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The small-skep-method measuring CO2respiratory rate of plant seeds was improved utilizing CO2Infrared Gas Analyzer. The results showed that the modified small-skep-method was simple in operation and could monitor the data changes real-timely. Compared with the traditional method, the experimental data measured by the modified method had higher accuracy, and the coefficient of variation was smaller. The modified small-skep-method could overcome the defects of the traditional method to some extent, and make more scientific and rigorous experimental determination, so which can be used for undergraduate plant physiology experimental teaching.

respiratory rate; small-skep-method; improved method; experimental teaching

2014-08-25；

2014-09-24

2010年校級(jí)重點(diǎn)課程建設(shè)項(xiàng)目(植物生理生化實(shí)驗(yàn)系列課程)；2013年第三批國(guó)家級(jí)精品資源共享課立項(xiàng)項(xiàng)目(本科教育課程：植物生理學(xué)，序號(hào)796)

李海霞，實(shí)驗(yàn)師，博士，從事植物生理生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)與管理， E-mail:lihx2011@mail.hzau.edu.cn；

王學(xué)奎，副教授，博士，從事植物生理學(xué)與基礎(chǔ)生物化學(xué)教學(xué)與研究，E-mail: wang-xuekui@mail.hzau.edu.cn。

Q945.3

B

2095-1736(2015)01-0100-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.100