吳貽琛 萬志紅 辛紹杰

干細胞移植治療肝功能衰竭的研究進展及應(yīng)用前景

吳貽琛 萬志紅 辛紹杰

肝臟是機體新陳代謝的中心，參與多種生理功能，肝功能衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致降解各種毒性物質(zhì)、合成白蛋白等必需物質(zhì)、分泌細胞因子、防御細菌病毒入侵等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，病情常于短時間內(nèi)迅猛進展，出現(xiàn)以凝血機制障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群［1］。其發(fā)生機制十分復(fù)雜，從肝細胞大量死亡角度看，肝組織在肝功能衰竭發(fā)生過程中依次經(jīng)受了免疫損傷、缺血缺氧性損傷和內(nèi)毒素血癥的三重致死性打擊，在疾病的不同時期，各自占有一定的主導(dǎo)地位［2］。因此，在疾病的不同時期，治療方法也有所不同，但目前總體病死率高，治療仍是世界性難題。

目前臨床上治療肝功能衰竭的有效手段，主要包括人工肝和原位肝臟移植［3］。人工肝治療技術(shù)開展比較廣泛，結(jié)合內(nèi)科綜合治療，可以降低病死率，但存在潛在未知感染的風(fēng)險，且該手段并非病因治療，最終恢復(fù)還需依賴患者自身肝細胞的再生，故療效尚不理想。原位肝移植是目前公認(rèn)的治療肝功能衰竭最為有效的方法，但因供體缺乏、手術(shù)損傷、免疫排斥、長期應(yīng)用免疫抑制劑和高額的費用等缺陷，其臨床應(yīng)用嚴(yán)重受限，很多患者在漫長地等待移植供體過程中死亡。因此，及時有效的支持治療和最大限度促進肝細胞再生將有助于肝功能衰竭患者自行恢復(fù)或者渡過等待移植時間的難關(guān)［4］。

近年來隨著細胞生物學(xué)尤其是干細胞生物學(xué)的迅速發(fā)展，干細胞治療在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域取得了重大進展。干細胞治療是指將干細胞或由其分化產(chǎn)生的功能細胞直接或經(jīng)體外遺傳技術(shù)處理后，植入病變部位，使干細胞在組織中生長分化，以代替喪失功能的病變細胞，重構(gòu)損傷組織，恢復(fù)器官功能［5-9］。有研究［10-11］證實干細胞在治療肝臟疾病的實驗中已取得不錯的療效。干細胞移植具有供體細胞來源豐富、手術(shù)損傷小、免疫排斥少、可重復(fù)使用、費用低等優(yōu)點，有望成為替代療法的新選擇，為肝功能衰竭治療開辟新的途徑。

干細胞以多種形式存在于人體內(nèi)，他們的共同特點是增殖能力極強并且可以分化為其他多種細胞。自細胞治療技術(shù)開展以來，治療細胞由最初的同種異體成熟肝細胞，發(fā)展為異種肝細胞、胎肝細胞、骨髓干細胞、臍血干細胞、外周血干細胞、胚胎干細胞、誘導(dǎo)型多能干細胞等。

一、胚胎干細胞

胚胎干細胞（em bryonic stem cell，ESC）：ESC屬于全能干細胞，是干細胞家族分化潛能最高的一種細胞，可經(jīng)誘導(dǎo)分化為外、中、內(nèi)胚層的多種細胞，從而成為一個身體組織或器官的細胞，包括肝細胞。因此，理論上它們可用于肝再生。ESC目前的研究工作大多數(shù)集中于探索有效的方法來誘導(dǎo)其分化，使其成為有功能的肝細胞，并科學(xué)、客觀地確定這種分化的完整性。Touboul等［12］應(yīng)用激活素、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn) G F）-2、骨形態(tài)生成蛋白-4、磷酸肌醇-3激酶（phosphoinositide-3kinase，PI-3 K）抑制劑和F G F-10、維甲酸、激活素受體拮抗劑分兩步誘導(dǎo)ESC分化，并成功獲得了肝細胞。ESC分化的判斷標(biāo)準(zhǔn)非常重要，確定是否成功誘導(dǎo)分化出有功能的肝細胞，不僅在于白蛋白的合成和分泌，也在于吲哚花青綠的吸收和釋放、糖原儲存、細胞色素P450氧化代謝功能等。目前，人類胚胎內(nèi)胚層分化而來的ESC移植給急性肝損傷小鼠后，可在小鼠體內(nèi)分化成肝細胞，完成肝細胞的功能［13］。但是，ESC作為肝干細胞移植的種子細胞還存在一些限制，例如，它的獲得需要克服倫理的障礙，而且移植后又有致畸胎瘤的潛在風(fēng)險。

二、骨髓干細胞

骨髓干細胞（bone marrow stem cell，B M SC）是目前干細胞研究的重點及熱點，原因可能是不論體內(nèi)還是體外實驗，B M SC的獲得都相對更加容易。B M SC主要有以下兩種，即可生成各種血細胞的造血干細胞和位于骨髓間質(zhì)的間充質(zhì)細胞，它們都具有在一定條件下誘導(dǎo)分化為其他細胞的能力，因此理論上在特定的條件及環(huán)境誘導(dǎo)下，它們可以逐步分化為肝臟再生所需的細胞，幫助受損肝臟完成正常生理功能，達到治療目的，且不涉及醫(yī)學(xué)倫理。Petersen等［14］1999年首先報道，用2-A FF（2-acetvlamin of luorene）阻斷大鼠肝細胞增殖，C Cl4造成肝細胞損傷后，進行性別交叉骨髓細胞移植或者全肝移植，在肝臟中發(fā)現(xiàn)來源于骨髓的肝細胞。Theise等［15］又報道了女性患者接受男性供體的骨髓移植后，受體的一些肝細胞和膽管上皮細胞核內(nèi)含有Y染色體。兩者均證明了骨髓干細胞能夠在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝卵圓細胞甚至成熟的肝細胞和膽管細胞。Miyazaki等［16］通過切除90%的動物肝臟建立A L F模型，并體外誘導(dǎo)B M SCs向肝樣細胞分化后治療動物A L F，取得了良好的效果。

（一）造血干細胞 造血干細胞（H ematopoietic stem cells，H SC）是人類最早發(fā)現(xiàn)的一種，也是目前研究最多的一種，已廣泛應(yīng)用于細胞替代治療、基因治療及組織工程，體外分離、純化技術(shù)也最成熟。H SC表面抗原標(biāo)志主要有：C D34+、C D34-Lin-、C D133+、K D R+等，來源于多種組織，如骨髓、臍血、外周血和胎肝等，以骨髓中數(shù)量最多。有研究證實［17］，高度純化的H SC不僅能補充多種造血系統(tǒng)成分，還可以在添加酪氨酸的肝損傷動物模型中分化為肝細胞，治療肝功能衰竭。目前，國內(nèi)外已開展多項骨髓來源H SC治療肝功能衰竭的臨床試驗，結(jié)果顯示，接受H SC治療的患者體內(nèi)可檢測到肝細胞再生，并伴有血清T BIL下降、A L B升高及凝血功能改善［18-19］。另外，多個研究中心也開展了外周血H SC治療肝病的研究。如Di Cam pli等［20］用G-CSF動員急性肝功能衰竭患者H SC，證實外周血C D34+細胞數(shù)量增加。國內(nèi)的Yan等［21］采用外周血H SC治療H B V相關(guān)的慢性肝功能衰竭，1周后患者的A L B明顯升高，A L T、A ST和T BIL下降，隨訪1年，患者Child-Turcotte-Pugh評分明顯改善。Gordon等［22］先予采用G-CSF動員，再由外周血中提取C D34+細胞，體外培養(yǎng)擴增后回輸?shù)闹委煼椒ǎ颊甙Y狀緩解、肝功能改善，所有患者在治療1年后仍存活，生化指標(biāo)持續(xù)改善。李楠等［23］開展的外周血H SC治療慢性肝功能衰竭也有相似的結(jié)果。

（二）間充質(zhì)干細胞（mesenchy mal stem cell，M SC） 這是一種具有多向分化潛能的非造血干細胞，可分化為肝細胞、庫普弗細胞、膽管細胞及肝竇內(nèi)皮細胞等多種肝臟組成細胞。M SC最初是由骨髓中分離得到，為造血干細胞的發(fā)育分化提供必需的微環(huán)境，之后又在皮膚、胰腺、臍帶及脂肪等多種組織中分離得到，來源豐富。研究發(fā)現(xiàn)M SC具有多種細胞表面抗原，但無特異性，一般認(rèn)為表達C D13、C D29、C D44、C D54、C D73、C D90、C D105、C D166、Stro-1等，不表達C D11b、C D14、C D31、C D34、C D45、C D79a、H L A-D R等［24］。M SC可以在體外大量擴增和長期培養(yǎng)，不僅可作為肝干細胞移植的種子細胞，而且易于接受外源基因的導(dǎo)入，用作基因治療的靶細胞。目前已發(fā)表的B M-M SCs移植試驗中，大部分應(yīng)用單純B M-M SCs移植的方法，總體療效良好，有較高的安全性。B M-M SCs除了部分分化為相應(yīng)組織細胞如肝細胞外，同時可合成多種生長因子，對肝臟內(nèi)局部微環(huán)境產(chǎn)生營養(yǎng)性旁分泌作用，包括抗炎、刺激內(nèi)源性細胞增殖和血管增生等。Suganu ma等［25，26］應(yīng)用B M-M SCs移植治療肝功能衰竭大鼠，發(fā)現(xiàn) B M-M SCs能夠分泌多種生長因子和細胞因子，促進肝臟血管再生及肝細胞增殖，抑制免疫細胞向肝臟遷移，調(diào)節(jié)肝功能衰竭大鼠肝臟及全身炎癥反應(yīng)，提高了大鼠的生存率。研究還表明［27］，B M-M SCs分泌的因子能夠逆轉(zhuǎn)急性組織損傷，可能與其上調(diào)IL-10水平有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，損傷的肝組織可以通過分泌細胞因子的方式促進干細胞向肝細胞的分化［28］。隨著B M-M SC再生研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有遷徙至損傷或者炎癥病變部位的能力，并可參與組織再生，但確切作用機制還沒有得到完全清楚的闡述。近年來，有關(guān)此方面的研究已經(jīng)逐步開展臨床實驗。Pietrosi［29］等分析了全世界27例肝功能衰竭患者 B M-M SCs移植術(shù)后的臨床資料，結(jié)果顯示，大部分患者病情有不同程度的好轉(zhuǎn)。Peng等［30］進行的自體B M-M SC移植的臨床研究，選取53例終末期乙肝患者為治療組，選擇同期105例終末期乙肝患者作為對照組，經(jīng)過隨訪觀察，證實治療組肝功、M eld評分等指標(biāo)改善均明顯優(yōu)于對照組，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥。以上一系列研究表明，自體 B M-M SCs移植安全有效，對于肝臟疾病的恢復(fù)具有較好的治療作用。

然而，并不是所有的研究都很樂觀，近期一些機構(gòu)的研究就曾證實［31-34］，由骨髓干細胞分化而來的肝細胞樣細胞沒有像所預(yù)期的那樣，擁有理想的自我復(fù)制能力。更有研究指出［35］，一定概率下骨髓干細胞可以分化為可生成膠質(zhì)纖維的肝星狀細胞和成纖維細胞，使肝臟內(nèi)生成了無法逆轉(zhuǎn)的瘢痕樣組織，當(dāng)其移植到患者體內(nèi)后，有可能促進肝纖維化的發(fā)展。

三、臍血干細胞

臍血干細胞（u m bilical cord blood stem cell，U C BSC）：臍血中含有無限制成體干細胞、間充質(zhì)干細胞、造血干細胞等多種干細胞成分。臍血中干細胞比例明顯高于成人骨髓及外周血。與B M SC相比，U C BSC更為原始，免疫原性較弱，不表達主要組織相 容 性復(fù) 合 基 因 （M H C）Ⅱ 類 分 子和 死 亡 因 子 配體（FasL），不表達 M H CⅠ類分子，也不表達白細胞分化因子7-1 （B7-1）、B7-2、C D40、C D40L等分子，可以逃避免疫監(jiān)視，來源廣泛，數(shù)量多，分化能力強，易于采集和保存，臍血受胎盤屏障的保護，被病毒、細菌污染的概率低，并且沒有倫理學(xué)的限制。目前，U C BSC分化為肝細胞的可行性及其移植的療效也已經(jīng)得 以 證 實［36，37］。

四、誘導(dǎo)多能干細胞

誘導(dǎo)多能 干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）：2006年，Takahashi［38］從24種與細胞多能性相關(guān)的基因中篩選出了4個轉(zhuǎn)錄基因（Oct4、Sox2、Klf4和c-M yc，O S K M），利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將這些因子轉(zhuǎn)染到小鼠的成體細胞（小鼠胚胎成纖維細胞和成體尾巴成纖維細胞），使這些細胞重新編程，利用另一個多能性標(biāo)記分子Fbx15的表達對轉(zhuǎn)染后的細胞進行篩選，得到了類似小鼠胚胎干細胞特性的多潛能干細胞，這就是誘導(dǎo)多能干細胞。2007 年，Takahashi［39］利用 O S K M 四種基因轉(zhuǎn)錄因子將人皮膚的成纖維細胞重新編程為iPSC。自此不同種屬、不同組織來源、不同年齡、不同疾病患者的細胞均可誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSC。iPSC像胚胎干細胞一樣具有多向分化潛能，在體內(nèi)可以分化為3個胚層來源的所有細胞，進而參與形成機體某種組織和器官，如肝臟［40］。理論上iPSC也可能發(fā)育為胚胎，重新孕育生命。Sullivan等［41］證實iPSC可分化為肝臟內(nèi)胚層細胞，且有效分化率為70%～90% ，iPSC源性肝細胞可表達肝細胞核因子（hepatocyte nuclear factor，H N F）-4α，并合成Alb、A FP、細胞色素（cytochro me P450，C Y P）-7 A1等肝臟功能性蛋白。iPSC的建立為獲得多潛能性干細胞提供了一個相對簡易可靠的新方法，而且個體特異來源的iPSC不會引起免疫排斥反應(yīng)，更為重要的是iPSC細胞的建立不需要卵細胞，也不需要破壞胚胎發(fā)育，避免了倫理上的限制，但仍存在重編程效率低、編程基因致癌風(fēng)險高、細胞增殖分化不可控等問題。

五、肝干細胞移植的理論基礎(chǔ)

目前關(guān)于歸巢的干細胞在終末期肝病治療中的作用機理尚無定論，主要有3種假說：①細胞轉(zhuǎn)分化學(xué)說，認(rèn)為歸巢的干細胞在體內(nèi)分化為功能性肝細胞，替代肝臟原有功能。②細胞融合學(xué)說，認(rèn)為歸巢的干細胞與原有肝細胞融合成為含兩套或多套染色體的細胞，再經(jīng)減數(shù)分裂形成“中間細胞”，從而發(fā)揮作用。③旁分泌學(xué)說［42］，目前被大多數(shù)學(xué)者所接受，該學(xué)說認(rèn)為歸巢的干細胞通過分泌各種細胞因子，如IL-6、T N F-α和H G F等，一方面作用于已損傷的肝細胞，改善其功能狀態(tài)；另一方面，抑制局部免疫反應(yīng)、增加血管再生，促進干細胞歸巢并減少其凋亡，延緩纖維化進展。目前還需要大量相關(guān)研究以明確干細胞的作用機理。

六、問題及展望

肝干細胞移植已經(jīng)初步應(yīng)用于臨床，但是作為一種新興的療法，目前仍存在一些技術(shù)問題：（一）干細胞本身生理特性的研究還需要進一步加深，闡明干細胞移植治療的作用機制及干細胞誘導(dǎo)分化機制，對后續(xù)研究非常重要；（二）對干細胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定等技術(shù)需要進一步簡化；（三）培養(yǎng)、分化過程中需要預(yù)防干細胞向腫瘤細胞分化；（四）移植細胞數(shù)量和療效之間的關(guān)系目前未闡明，動物實驗中移植數(shù)量多為 106～107個，而據(jù)推算，移植于人體的干細胞數(shù)量約需109個，確切的移植數(shù)量還需要大量研究來確定；（五）肝功能衰竭患者體內(nèi)的免疫狀態(tài)、內(nèi)毒素、高膽紅素使自身肝細胞呈大塊或亞大塊壞死而難以生存，干細胞的生存及功能狀態(tài)如何維持？（六）移植時機、移植途徑及細胞發(fā)揮功能所需時間也是值得研究的問題；（七）目前臨床上仍只能通過移植后功能檢測來評價干細胞移植后的療效，無法真正顯示干細胞的分布，因此需要尋求無創(chuàng)、簡便、有效的示蹤手段加以監(jiān)測；（八）干細胞與體內(nèi)組織細胞的相互作用機制以及影響仍有待進一步研究；（九）干細胞移植治療肝功能衰竭的療效還需要得到設(shè)計嚴(yán)格的臨床試驗的驗證。

盡管存在上述一些問題，但干細胞移植仍為肝功能衰竭患者提供了一條新的治療途徑。其具體作用機制仍亟待深入研究和探討，且干細胞真正應(yīng)用于臨床治療肝衰竭還有漫長的道路要走，但相信不久的將來，干細胞移植技術(shù)必將發(fā)揮更加重要的作用。

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三相并網(wǎng)逆變器的MPDPC策略如圖3所示,不同的電壓矢量產(chǎn)生不同的有功和無功功率變化,因此,存在多種方式去選擇合適的開關(guān)狀態(tài)去控制有功和無功功率。采樣三相電網(wǎng)電壓和電流,分別在8個矢量的作用下計算出下一周期的功率預(yù)測值,將預(yù)測值代入式(9),根據(jù)誤差最小化原則,選取最優(yōu)矢量。p*由直流電壓外環(huán)PI調(diào)節(jié)器的輸出與直流電壓的乘積給定,q*通常設(shè)為0,以實現(xiàn)單位功率因數(shù)運行。

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2014-12-02）

（本文編輯：魏清）

國家“十二五”重大專項（2012Z X10002004-005）；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目（13 Q N P192）

100853 北京，解放軍醫(yī)學(xué)院（吳貽琛、辛紹杰）；解放軍第三○二醫(yī)院肝硬化診療中心（吳貽?。?；解放軍第三○二醫(yī)院肝衰竭診療與研究中心（萬志紅、辛紹杰）

辛紹杰，E mail：xinshaojie302@163.co m