李 波，趙友云，高應(yīng)林

（1.湖北省中醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430061）

·檢驗科與實驗室管理·

CNAS－CL36首次修訂主要內(nèi)容解讀

李 波1，2，趙友云1，高應(yīng)林1

（1.湖北省中醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430061）

分子診斷的基礎(chǔ)是分析樣品中的基因及其表達產(chǎn)物，所涉及的技術(shù)除基因擴增檢驗外，還包括雜交試驗、核酸電泳分析、DNA測序、生物芯片等［1］。隨著分子診斷技術(shù)的日益發(fā)展與成熟，各級醫(yī)院逐步開展優(yōu)生優(yōu)育篩查、基因突變、異位與重排等分子遺傳病理的檢測［1］，在該領(lǐng)域建立公認的質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)一直備受關(guān)注［2］。近來，中國合格評定國家認可委員會（CNAS）修訂了2013版《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則在基因擴增檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS－CL36，13版應(yīng)用說明）［3］，發(fā)布了即將實施的2014修訂版《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS－CL36，14版應(yīng)用說明）［4］。此次修訂新增《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊》和《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》等引用文件，將國際標(biāo)準(zhǔn)ISO15189的要求推廣并應(yīng)用于分子診斷領(lǐng)域，為其規(guī)范化管理提供了更具操作性的指導(dǎo)，提高了對分子診斷檢測能力獲得認可的要求?，F(xiàn)將此次修訂的主要內(nèi)容分析如下。

1 結(jié)構(gòu)變化

14版和13版應(yīng)用說明分別以2012版和2008版《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則》（準(zhǔn)則）結(jié)構(gòu)編排為依據(jù)［5－6］，管理要求和技術(shù)要求發(fā)生了相互移動或整合，其條款修改明細對照見表1。有些修改只是條款發(fā)生改變，要求未變，如表中＊號標(biāo)記的修改所示。有些條款的要求具有普遍性和通用性，被作為對整個醫(yī)學(xué)實驗室的整體要求在12版準(zhǔn)則中提出，如從4.1.1.3倫理、5.1.5員工培訓(xùn)、5.10.1實驗室信息管理的文件化程序、5.2.2實驗室進入控制、5.3.2.7試劑和耗材記錄和5.3.1.4設(shè)備校準(zhǔn)和計量學(xué)溯源等方面對患者信息的保密性、實驗室限制進入、試劑和耗材管理記錄和定量檢測項目溯源等提出了更具體的要求，不再在14版應(yīng)用說明中贅述。

2 修改的主要內(nèi)容

14版應(yīng)用說明在13版的基礎(chǔ)上，加入了分子病理檢測等有關(guān)要求，在組織管理和技術(shù)要素方面提出了許多新的和更為嚴格的要求，主要體現(xiàn)在以下幾個方面。見表1。

2.1 組織和管理責(zé)任 著重強調(diào)了分子診斷的專業(yè)性:要求非獨立法人單位的醫(yī)學(xué)實驗室，自獲準(zhǔn)執(zhí)業(yè)之日起，開展分子診斷而不是醫(yī)學(xué)檢驗工作至少2年；并且在技術(shù)管理層必須至少有1名副高及以上專業(yè)技術(shù)職務(wù)資格，從事分子診斷而不是醫(yī)學(xué)檢驗工作至少5年。原因是分子診斷和生化及免疫等醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)屬于不同層面的診斷，整體上仍以手工為主，操作繁瑣［2］，管理者需要具有足夠工作經(jīng)驗的積累，以能承擔(dān)實驗室的多項職能，保證并提高最終的檢驗質(zhì)量，保證建設(shè)和維護實驗室質(zhì)量體系并持續(xù)改進。

2.2 人員 要求簽發(fā)病理報告的醫(yī)師“應(yīng)至少具有中級病理學(xué)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，并有從事分子病理工作的經(jīng)歷”，刪除了13版4.1.1對組織和管理的病理學(xué)診斷資質(zhì)要求，使14版應(yīng)用說明還適用于未開展病理檢驗室的相關(guān)醫(yī)療機構(gòu)的實驗室。要求從事分子診斷的人員“應(yīng)至少具有2名”，以能滿足日常檢測工作的需求，履行質(zhì)量管理體系相關(guān)的崗位職責(zé)。

對新員工的最初2次能力評審時限由2個月放寬為6個月，對他們能力的評估與授權(quán)應(yīng)根據(jù)他們各自的理論和實踐基礎(chǔ)，自我管理、工作和學(xué)習(xí)熱情與積極主動性、適應(yīng)新的工作環(huán)境等方面的綜合能力，對質(zhì)量體系培訓(xùn)掌握的廣度和深度逐步進行，符合因材施教、因需施教的教育實踐。

2.3 設(shè)施和環(huán)境條件 基因擴增檢驗標(biāo)本制備區(qū)和分子病理檢驗獨立的標(biāo)本前處理區(qū)均涉及臨床標(biāo)本的操作，需積極預(yù)防實驗室生物、化學(xué)安全事故，設(shè)備應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護要求［7］，“應(yīng)配置二級生物安全柜和洗眼器，實驗室附近還應(yīng)備有噴淋裝置”。為防止交叉污染，除了嚴格分區(qū)操作，各個工作區(qū)物品專區(qū)專用外，工作結(jié)束后應(yīng)立即對工作區(qū)進行清潔，必要時進行消毒及去污染。

2.4 實驗室設(shè)備、試劑和耗材

2.4.1 設(shè)備 為長期儲存提取的RNA和待檢RNA樣品［8］，亦便于在出具結(jié)果報告后復(fù)檢或做附加檢驗，RNA的檢測宜配備－70℃的冷凍設(shè)備。組織標(biāo)本前處理區(qū)應(yīng)配備切片機、裱片機、切片刀、電熱恒溫箱等必要的設(shè)備。

2.4.2 設(shè)備校準(zhǔn) 設(shè)備的校準(zhǔn)是計量溯源的基礎(chǔ)、檢驗質(zhì)量保證的前提，是實驗室技術(shù)能力的重要保障之一。實驗室應(yīng)按要求定期對強檢設(shè)備進行檢定，對直接或間接影響檢驗結(jié)果的非強檢設(shè)備進行外部或內(nèi)部校準(zhǔn)。因此，除應(yīng)定期對PCR儀、加樣器、溫度計和恒溫設(shè)備進行校準(zhǔn)外，還應(yīng)定期對離心機和生物安全柜等進行校準(zhǔn)。

2.4.3 試劑和關(guān)鍵耗材的管理 這也是14版應(yīng)用說明修訂的重點之一，要求“實驗室應(yīng)建立試劑和關(guān)鍵耗材（如離心管、帶濾芯的吸頭）的驗收程序，相應(yīng)程序中應(yīng)有明確的判斷符合性的方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?！蓖ㄟ^觀察確保包裝的完整性和有效期足夠長，通過實驗確保試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率、關(guān)鍵耗材不存在抑制物、試劑的批間差異等符合要求。定量檢測驗證實驗方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)可參考附錄A6，即選取覆蓋測量區(qū)間（包括陰性、臨界值、低值、中值和高值）5個舊批號檢測過的樣品，采用新批號試劑或/和耗材復(fù)檢，至少4個樣品測量結(jié)果偏倚小于±7.5%，其中陰性和臨界值樣品必須符合預(yù)期。定性檢測的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進行試劑批號驗證。由此可見，每更換一批試劑或關(guān)鍵耗材都要做批號驗證，結(jié)果滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方能啟用新試劑或/和關(guān)鍵耗材。若批號驗證結(jié)果不符合要求時，需要查找原因，如果實驗室懷疑提取試劑有質(zhì)量問題，可采取有關(guān)技術(shù)確認核酸提取的純度。

2.5 檢驗前過程 由于RNA酶的廣泛存在，RNA在制備過程中很容易被降解。血漿或組織中及提取好的RNA的穩(wěn)定性受處理方法和儲存條件等影響不一［9－10］。因此，核酸檢測樣品在分離血漿或提取前后都應(yīng)適當(dāng)儲存。對于超長期儲存后的標(biāo)本，在使用前還應(yīng)再次評估標(biāo)本的完整性。組織樣品應(yīng)采用10%中性緩沖的甲醛固定，固定液的量和固定時間應(yīng)符合檢測要求。

2.6 檢驗過程

2.6.1 檢驗方法和程序的性能驗證 14版提高了檢驗方法和程序的性能驗證要求，定量檢測增加了線性和抗干擾能力的驗證?？蓤蟾娣秶炞C的前提是做線性試驗，當(dāng)測量線性范圍足夠?qū)挘€性內(nèi)的測量范圍即為可報告范圍。黃疸、溶血、脂血、藥物類及常見病原體的交叉反應(yīng)等在多大程度上干擾核酸檢測，報道并不一致，有可能跟試劑、方法等有關(guān)。由此可見驗證檢測分析程序抗干擾能力的重要性和必要性。定性檢測項目也要驗證抗干擾能力，準(zhǔn)確度的驗證則要求采用方法學(xué)比較或與金標(biāo)準(zhǔn)比較。此外，檢測應(yīng)使用驗證過的核酸抽提和純化方法，必要時進行核酸定量。所有驗證結(jié)果應(yīng)經(jīng)過授權(quán)人審核。

2.6.2 產(chǎn)前診斷 胎兒檢驗前，應(yīng)在同一實驗室檢驗雙親的突變狀態(tài)。宜防止母體細胞污染，采集雙份孕婦標(biāo)本做雙份羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析，在完成診斷前應(yīng)保留備份培養(yǎng)物并跟蹤監(jiān)測實驗的準(zhǔn)確性。

2.6.3 原位雜交（ISH） 應(yīng)有明確和統(tǒng)一ISH陽性信號的標(biāo)準(zhǔn)，并建立本實驗室的陽性閾值。組織病理ISH，應(yīng)結(jié)合組織形態(tài)進行結(jié)果判讀，并采用國際通用的評分標(biāo)準(zhǔn)。

2.7 檢驗結(jié)果質(zhì)量的保證

2.7.1 室內(nèi)質(zhì)控 每次實驗定量檢測項目應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和陽性質(zhì)控物，質(zhì)控數(shù)據(jù)要符合確保試驗的穩(wěn)定性和檢驗結(jié)果的可靠性的質(zhì)控規(guī)則；定性檢測項目應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和/或陽性質(zhì)控物，陰陽性要符合預(yù)期。應(yīng)保留DNA質(zhì)量評價記錄。需要時，選擇內(nèi)標(biāo)以評價所提取RNA的完整性，并保留RNA質(zhì)量評價記錄及假陰性率監(jiān)測記錄。應(yīng)由病理醫(yī)師評價用于基因突變檢測的樣品，并決定是否需要對腫瘤細胞進行富集。當(dāng)分子診斷結(jié)果與臨床和其他實驗結(jié)果不符時，應(yīng)記錄并分析原因，適當(dāng)時采取糾正措施。

2.7.2 能力驗證、實驗室間比對及替代方案 刪除了替代方案“實驗室以評價檢驗結(jié)果與臨床診斷一致性判斷檢驗結(jié)果的可接受性”。

2.7.3 實驗室內(nèi)部比對 檢測同一項目且生物參考區(qū)間相同的兩套及以上檢測系統(tǒng)比對頻次由每年至少2次改為至少1次，增加檢驗人員的比對與考核，每年至少1次。比對結(jié)果應(yīng)符合要求。

2.8 檢驗后過程 為便于復(fù)查，實驗室應(yīng)規(guī)定原始樣品、核酸提取物和/或核酸擴增產(chǎn)物的保存期限。為便于追溯，凝膠圖像和斑點雜交條帶和/或通過掃描、拍照等方式保留的結(jié)果應(yīng)作為技術(shù)記錄參照相關(guān)行業(yè)要求保存。檢驗報告單作為舉證倒置法律文書病歷的重要組成部分，門（急）診類保存不少于15年，住院類不少于30年［11］。

2.9 結(jié)果報告 分子診斷和其他檢測技術(shù)一樣，都有其局限性，如核酸檢測的檢出限、抗干擾能力，突變基因檢出的特異度等，實驗室需要在此類報告中對此作出提示［12］，提出進一步檢測的建議，并提供相關(guān)咨詢服務(wù)的聯(lián)系方式。

3 小 結(jié)

14版應(yīng)用說明已與12版準(zhǔn)則一起自2014年11月1日始同步施行。本文從14版對13版應(yīng)用說明的改進入手，結(jié)合12版和08版準(zhǔn)則的差別，對此次修訂的主要內(nèi)容作出了詳細的解讀，旨在有助于分子診斷領(lǐng)域有關(guān)人員更好地理解和運用準(zhǔn)則，提高其質(zhì)量和能力，建立并不斷完善實驗室質(zhì)量管理體系。

［1］劉永華，陳化禹.分子診斷的應(yīng)用研究進展［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（3）:265－266.

［2］關(guān)明，劉維薇.CAP和ISO15189認可對臨床分子診斷方法學(xué)驗證的要求［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（2）:105－108.

［3］中國合格評定國家認可委員會.CNAS－CL36:2012醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則在基因擴增檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明［S］.北京:中國合格評定國家認可委員會，2013.

［4］中國合格評定國家認可委員會.CNAS－CL36:2012醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明（修訂版）［S］.北京:中國合格評定國家認可委員會，2014.

［5］中國合格評定國家認可委員會.CNAS－CL02:2012醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則（ISO15189:2012）［S］.北京:中國合格評定國家認可委員會，2012.

［6］中國合格評定國家認可委員會.CNAS－CL02:2008醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則（ISO15189:2007）［S］.北京:中國合格評定國家認可委員會，2008.

［7］中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)［2010］19號醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法［S］.北京:中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司，2010.

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［9］陳勇，周華蓉.不同保存條件對血清熒光定量HCVRNA檢測的影響［J］.分子診斷與治療雜志，2009，1（4）:245－247.

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［11］中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.國衛(wèi)醫(yī)發(fā)［2013］31號醫(yī)療機構(gòu)病歷管理規(guī)定（2013年版）［S］.北京:中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，2013.

［12］樊綺詩，吳蓓穎.臨床遺傳學(xué)診斷中應(yīng)予以關(guān)注的問題［J］.診斷學(xué)理論與實踐，2012，11（4）:329－331.

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.072

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1673－4130（2015）10－1470－04

2015－01－09）