劉珍珍 楊麗萍 陳能 王文榮 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所三水中心 （佛山 528137）

三氯生，學(xué)名“二氯苯氧氯酚”，化學(xué)分子式為C12H7Cl3O2，又名“三氯新”、“三氯沙”等，是一種廣譜抗菌劑，被廣泛用作化妝品、洗滌劑、醫(yī)療消毒及衛(wèi)生保健產(chǎn)品的活性成分等[1]。因其對皮膚無刺激性和較低的細(xì)胞毒性，目前三氯生多是通過乳膏的形式進(jìn)行皮膚疾病的治療[2]。

但是，三氯生是疏水性抗菌劑且容易失活，在水凝膠基質(zhì)中容易聚集，從而導(dǎo)致生物利用率降低[3]。因此，如何將疏水的三氯生均勻分散到親水性水凝膠基質(zhì)中，是三氯生在臨床應(yīng)用中面臨的難題。目前的三氯生乳膏多是通過添加甘油、乙二醇等增溶劑增加其溶解性，仍難以解決持續(xù)釋放三氯生以及提高其穩(wěn)定性的目的。而且，乙二醇等添加劑會產(chǎn)生神經(jīng)毒性[4]。

利用兩親性Pluronic F-88 聚合物在水溶液中負(fù)載疏水的三氯生，然后再與環(huán)糊精相互作用制備原位包埋三氯生的超分子水凝膠。該水凝膠具備優(yōu)異的生物相容性和觸變性能[5]，且對三氯生有緩釋效果，并長時間保持三氯生的活性。

1.原料與試劑

Pluronic F-88（聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇，EO103-PO40-EO103）：Sigma 公司，純度 ≥ 99%；α-環(huán)糊精（α-CD）：日本TCI 公司，純度 ≥ 99%；三氯生（二氯苯氧氯酚，TC）：日本TCI公司，純度 ≥ 98%；其他試劑購自廣州齊云生物科技有限公司，均為分析純。

2.載三氯生水凝膠的制備及表征

2.1 制備方法

將2.0 g F-88 溶解于30 mL 水中，然后在冰浴條件下逐滴滴加20 mL 含TC 的丙酮溶液（1 mg/mL）。待滴加完成后將冰浴撤掉，室溫條件下攪拌4 小時后于37 ?C 繼續(xù)水浴震蕩24 小時，得到澄清透明溶液。將此溶液室溫條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至體積減少至30 mL，用0.45 μm 過濾頭過濾，得到載TC 的膠束（F-88/TC）。通過紫外—可見分光光度計(jì)測定樣品在282 nm 處的吸光度值[6]，從而計(jì)算膠束對TC 的負(fù)載量為52.4 mg/g。

將所得F-88/TC 膠束與一定濃度（10、12 或14%）的α-CD 溶液等體積混合，室溫條件下靜置過夜，即可得到負(fù)載TC 的超分子水凝膠。

2.2 水凝膠物理性質(zhì)表征

為表征凝膠樣品的觸變性，對其進(jìn)行穩(wěn)態(tài)剪切掃描和剪切躍遷掃描表征。將凝膠樣品置于TA ARES/RFS 高級流變擴(kuò)展系統(tǒng)，于50 mm 平行板夾具和25?C 條件下進(jìn)行測試。測定樣品剪切粘度時，設(shè)定剪切速率范圍為10—0.01 s-1；測定樣品的觸變行為時，設(shè)定剪切速率在10 s-1和0.1 s-1條件下交替變化。

2.3 三氯生的體外釋放測定

將100 μL 負(fù)載TC 的超分子水凝膠加入800 μL PBS（0.01 M, pH = 7.4）緩沖溶液中，置于37?C 的水浴中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。每隔一段時間，從上層清液中小心取出200 μL 釋放液，然后將新鮮的200 μL PBS 緩沖溶液補(bǔ)加到燒杯中。取出的釋放液用200 轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心分離，除去釋放液中的懸浮物。TC 的含量通過紫外—可見分光光度計(jì)測得，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2> 0.999。

2.4 抗菌實(shí)驗(yàn)

2.4.1 微生物生長曲線

用LB 培養(yǎng)基將載抗菌劑的凝膠配制成TC濃度為50 ppm 的懸濁液，并且配制空白對照樣。在無菌室將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別從斜面刮下，轉(zhuǎn)接入已滅菌好的10 mL 培養(yǎng)液中。37?C 下恒溫活化8 h，然后取出2.5 mL 轉(zhuǎn)接入含有50mL 培養(yǎng)液的錐形瓶中，繼續(xù)活化2h。用0.8 wt.%的生理鹽水離心洗滌三次，并且稀釋成一定濃度的菌樣。將菌樣加入裝有30mL 待測樣品的錐形瓶中。在37?C 下恒溫培養(yǎng)，定時取樣測量。利用紫外—可見分光光度計(jì)測量樣品在600 nm 處的吸光度值，從而得到細(xì)菌的菌量。

2.4.2 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

稱取牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、瓊脂2 g 溶于100 mL 蒸餾水中，加熱融化，待溶液冷至室溫時，用1.0 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)pH 至7.2，高壓滅菌約30 min。待溶液冷卻至約50?C，分別加入大腸桿菌種和金黃色葡萄球菌種，冷卻形成固體培養(yǎng)基。利用打洞法注入水凝膠樣品（水凝膠樣品事先冰箱保存一個月），于37?C恒溫下培養(yǎng)30 h，觀察抑菌圈大小。

3.結(jié)果與討論

Pluronic F-88 是一類聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇兩親性嵌段聚合物，該類嵌段聚合物在水溶液中可自組裝形成膠束，膠束的核可負(fù)載疏水藥物TC，膠束的殼因?yàn)榫垡叶兼湺蔚拇嬖?，可以與α-CD 發(fā)生主客體作用形成水凝膠[5]。

圖1. 不同α-CD 含量的水凝膠的剪切粘度隨剪切速率的變化曲線

圖2. 含6.0% α-CD 的水凝膠的觸變測試結(jié)果

圖3. 不同α-CD 含量的水凝膠對TC 的體外釋放曲線

該類超分子水凝膠屬于物理凝膠，可被外加的機(jī)械作用力破壞，從而導(dǎo)致凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，凝膠發(fā)生流動；而當(dāng)外力撤去后，其結(jié)晶結(jié)構(gòu)又可恢復(fù)到起始狀態(tài)。該水凝膠的這種觸變行為使其在醫(yī)用敷料、可注射藥物載體等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[7]。為研究α-CD 濃度對超分子水凝膠觸變性的影響，通過穩(wěn)態(tài)剪切掃描和觸變環(huán)掃描對不同組分的超分子水凝膠進(jìn)行了表征。圖1 所示為凝膠樣品的剪切粘度隨剪切速率的變化規(guī)律。凝膠樣品具有剪切變稀的性質(zhì)，隨著剪切速率的增加，其剪切粘度迅速減小。且隨α-CD濃度的增加，凝膠樣品的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，剪切變稀特性增強(qiáng)。

圖2 所示為凝膠樣品的觸變性質(zhì)表征，以含6.0% α-CD 的水凝膠樣品為例：在低剪切速率（0.1 s-1）條件下，凝膠樣品在測試開始階段表現(xiàn)出剪切變稀的性質(zhì)，10 s 之后基本達(dá)到平衡；當(dāng)剪切速率增加到10 s-1時，凝膠樣品的剪切粘度瞬間降低至0.48 Pa·s 左右且達(dá)到平衡，此時體系表現(xiàn)出良好的流動性；120 s 后，當(dāng)剪切速率再次恢復(fù)到小速率0.1 s-1時，凝膠樣品的粘度又迅速恢復(fù)至90 Pa·s 左右。該類凝膠體系表現(xiàn)出良好的觸變性能，有望作為一類新型可注射藥物載體得到廣泛應(yīng)用。

水凝膠作為藥物載體，其重要優(yōu)勢之一在于對藥物分子具有良好的控制釋放和持續(xù)釋放的效果[8]。圖3 所示為含不同α-CD 濃度的超分子水凝膠對TC 的體外釋放行為?？梢钥闯?，一系列不同配比的凝膠體系對TC 均有良好的控釋效果，所有樣品均沒有出現(xiàn)明顯的暴釋現(xiàn)象，且釋放過程可持續(xù)14 天以上。隨著體系中α-CD 濃度的增加，超分子水凝膠的強(qiáng)度增大，其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，因而對TC 的釋放更加緩慢。因此，可以通過調(diào)節(jié)體系中α-CD 濃度達(dá)到合理緩釋藥物的目的。

圖4. 大腸桿菌（a）和金黃葡萄球菌（b）在不同樣品作用下的生長曲線（凝膠樣品中α-CD 的濃度為6%）

圖5. 凝膠樣品的抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果（凝膠樣品中α-CD 的濃度為6%）

圖4 所示為不同樣品條件下大腸桿菌和金黃葡萄球菌的生長曲線。對于未負(fù)載藥物的凝膠材料，大腸桿菌和金黃葡萄球菌均持續(xù)了7 h 的對數(shù)期后進(jìn)入穩(wěn)定期，與空白對照組無顯著性差異。對于負(fù)載TC 的凝膠樣品，其抑菌效果顯著，大腸桿菌和金黃葡萄球菌在用藥8 小時候均趨向于零，與純的TC 無明顯差異。在4—6 小時期間，負(fù)載TC 的凝膠樣品比純TC 的抑菌效果超差，可能是因?yàn)門C 從凝膠基質(zhì)中釋放出來需要一定的時間所導(dǎo)致。

圖5 所示為載TC 的凝膠樣品對大腸桿菌和金黃葡萄球菌的抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，保存時間一個月的凝膠樣品對兩種微生物均有良好的抑菌效果，抑菌圈明顯。同時，凝膠材料對金黃葡萄球菌的抑菌效果要好于大腸桿菌。因此，該抗菌水凝膠可長時間保持TC 的生物活性，在皮膚外用治療方面具有較好的應(yīng)用前景。

4.結(jié)論

以Pluronic F-88 為疏水的TC 的穩(wěn)定劑，以及利用F-88 與α-CD 的相互作用，制備出一類新型的負(fù)載TC 的水凝膠材料。凝膠材料有良好的剪切變稀的性質(zhì)和觸變性能，可作為可注射藥物載體和凝膠敷料進(jìn)行應(yīng)用。負(fù)載TC 的凝膠樣品體現(xiàn)出良好的抗菌性能，對大腸桿菌和金黃葡萄球菌均有良好的抑菌效果。

[1] H. P. Schweizer, FEMS Microbiology Letters 202, 1 (2001).

[2] M. C. McBride, R. K. Malcolm, A. D. Woolfson, and S. P. Gorman, Biomaterials 30, 6739 (2009).

[3] B. A. Wilson, V. H. Smith, F. Denyelles, and C. K. Larive, Environ. Sci. Technol. 37, 1713 (2003).

[4] D. R. Orvos, D. J. Versteeg, J. Inauen, M. Capdevielle, A. Rothenstein, and V. Cunningham, Environmental Toxicology and Chemistry 21, 1338 (2012).

[5] Dong Ma, Li-Ming Zhang, Xi Xie, Tao Liu, Min-Qiang Xie. Tunable supramolecular hydrogel for in-situ encapsulation and sustained release of bioactive lysozyme. Journal of Colloid and Interface Science 2011, 359: 399-406.

[6] Dong Ma, Ting Wu, Jinglin Zhang, Minsong Lin, Wenjie Mai, Shaozao Tan, Wei Xue, Xiang Cai. Supramolecular hydrogels sustained release triclosan with controlled antibacterial activity and limited cytotoxicity. Science of Advanced Materials 2013, 5: 1400-1409.

[7] Dong Ma and Li-Ming Zhang. Supramolecular gelation of a polymeric prodrug for its encapsulation and sustained release. Biomacromolecules 2011, 12: 3124-3130.

[8] E. Josef, M. Zilberman, and H. Bianco-Peled, Acta Biomaterialia 6, 4642 (2010).