趙玉寶，丁芹，潘玉，王莉娜，張言超

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染性疾病科，江蘇 徐州 221002)

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江蘇徐州地區(qū)慢性乙型肝炎病人HBV耐藥突變分析

趙玉寶，丁芹，潘玉，王莉娜，張言超

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染性疾病科，江蘇 徐州 221002)

目的 分析徐州地區(qū)慢性乙型肝炎(CHB)病人乙型肝炎病毒(HBV)基因型及耐藥變異位點(diǎn)的分布特點(diǎn)。方法 收集2013年5月—2013年11月在我院就診的門(mén)診及住院CHB病人216例，采用核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記探針雜交方法檢測(cè)病人血清HBV DNA，通過(guò)測(cè)序分析檢測(cè)病人血清中的HBV基因分型及耐藥變異位點(diǎn)。結(jié)果 本組216例病人中，HBV基因C型207例(95.83%)，B型9例(4.17%)；病毒變異的85例，無(wú)變異的131例，變異率為39.35%；變異位點(diǎn)有rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtS202、rtM204、rtV207、rtS213、rtV214、rtQ215、rtN236、rtN238。各突變位點(diǎn)中，rtM204和rtL180位點(diǎn)的突變檢出率較高，分別為21.30%和13.89%。與拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定耐藥相關(guān)的病毒基因位點(diǎn)的突變檢出率分別為29.63%、20.37%、12.96%。結(jié)論徐州地區(qū)HBV基因型分布以C型多見(jiàn)，突變株占檢測(cè)病毒株的39.35%；與拉米夫定和阿德福韋酯耐藥相關(guān)的基因位點(diǎn)突變檢出率相對(duì)較高，與恩替卡韋耐藥相關(guān)的基因位點(diǎn)突變檢出率相對(duì)較低。

肝炎病毒，乙型；基因型；突變

口服核苷(酸)類(lèi)似物方法是目前抗乙型肝炎病毒(HBV)治療的重要手段之一。為了解江蘇徐州地區(qū)HBV耐藥位點(diǎn)分布特點(diǎn)，本文分析了我院216例慢性乙型肝炎(CHB)病人血清HBV基因分型及耐藥位點(diǎn)，旨在為臨床提供更好的抗病毒用藥依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

2013年5月—2013年11月，我院住院及門(mén)診就診的CHB病人216例，其中男158例，女58例；平均年齡(40.78±12.75)歲。

1.2試劑與儀器

ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)由美國(guó)ABI公司提供，HBV及耐藥突變檢測(cè)試劑盒由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 空腹采集病人不抗凝血3 mL，以2 000 r/min離心5 min分離血清，置1.5 mL離心管中-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2血清HBV DNA檢測(cè) 采用核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記探針雜交方法。PCR擴(kuò)增步驟如下。①HBV DNA模板提取：按照上海申友生物技術(shù)有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。②PCR反應(yīng)：每個(gè)反應(yīng)加入HBV PCR反應(yīng)液20 μL，Taq酶及UNG酶1 μL，標(biāo)本、臨界對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照或者定量參比品各4 μL。反應(yīng)條件：42 ℃保溫5 min，94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性7 s，60 ℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)；37 ℃恒溫保溫。③PCR產(chǎn)物酶解：自HBV DNA≥5×106U/L的樣本中取PCR產(chǎn)物3 μL，加入2 μL SAP的混合物，混勻，37 ℃下作用60 min，80 ℃下作用15 min，然后4 ℃下保存。④PCR酶解產(chǎn)物的測(cè)序：取PCR酶解產(chǎn)物3 μL，加測(cè)序試劑(bigdye)1 μL和測(cè)序引物2 μL進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為96 ℃變性1 min，96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，25個(gè)循環(huán)，最后4 ℃恒溫保存。

1.3.3測(cè)序產(chǎn)物純化及耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè) 按照上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，在ABI公司3130型基因測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本文216例受檢樣本中檢測(cè)到病毒變異85例，變異率為39.35%。各位點(diǎn)變異例次及相關(guān)耐藥情況見(jiàn)表1。在所檢測(cè)到的HBV耐藥變異中，拉米夫定相關(guān)變異(173、180、204、207、213位點(diǎn))共檢測(cè)到99例次，存在于64例樣本中(變異率29.63%)；阿德福韋酯相關(guān)變異(181、207、214、215、236、238位點(diǎn))共檢測(cè)到57例次，存在于44例樣本中(變異率20.37%)；替比夫定相關(guān)變異204位點(diǎn)I變異28例次(變異率12.96%)；180+204位點(diǎn)聯(lián)合變異27例次(變異率12.50%)等，變異率比較差異有顯著意義(χ2=2 292.0，P<0.05)。

表1 HBV各位點(diǎn)變異及相關(guān)耐藥情況

3 討 論

核苷(酸)類(lèi)似物是治療CHB的重要藥物之一，但近年來(lái)隨著核苷(酸)類(lèi)似物的廣泛應(yīng)用，其耐藥變異問(wèn)題已引起大家的廣泛關(guān)注。所有核苷(酸)類(lèi)似物耐藥基因突變位點(diǎn)都位于HBV DNA聚合酶基因區(qū)(逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū))，目前已知常見(jiàn)的耐藥突變位點(diǎn)主要見(jiàn)于逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的A、B、C、D區(qū)[1]。

研究顯示，與拉米夫定相關(guān)主要耐藥突變位點(diǎn)有rtL180M、rtM204V和rtM204I[2]。本研究中檢測(cè)到rtL180M變異30例次，rtM204V變異19例次，rtM204I變異28例次，此外尚有報(bào)道稱(chēng)173L、207I/L/M、213T位點(diǎn)亦與拉米夫定耐藥相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，173L變異2例次，207I、L、M變異9例次，213T變異11例次。以上所有與拉米夫定耐藥相關(guān)的位點(diǎn)的變異率為29.63%，提示拉米夫定的變異率較高。郭香娟等[3]研究結(jié)果表明，拉米夫定誘導(dǎo)的YMDD變異組的HBV DNA轉(zhuǎn)陰率明顯低于YMDD未變異組，以上研究都提示拉米夫定不宜作為臨床抗病毒治療的首選藥物。

阿德福韋酯的主要相關(guān)變異位點(diǎn)有rtA181V和rtN236T[4]。本研究檢測(cè)到181位點(diǎn)變異例次為22例次(變異率10.19%)，236位點(diǎn)變異7例次(變異率3.24%)，尚有報(bào)道稱(chēng)rtQ215S/P/H、rtV181A、rtN238H、rtM207V、rtL180M等位點(diǎn)亦與阿德福韋酯耐藥發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，207位點(diǎn)變異9例次，214位點(diǎn)變異6例次，215位點(diǎn)變異3例次，238位點(diǎn)變異6例次，綜合以上所有與阿德福韋酯耐藥相關(guān)的基因位點(diǎn)的變異率為20.37%。提示單獨(dú)應(yīng)用阿德福韋酯產(chǎn)生耐藥的可能性較大。

替比夫定和拉米夫定耐藥基因序列相似。臨床觀察顯示，替比夫定的耐藥位點(diǎn)只存在于rtM204I。本研究檢測(cè)到此位點(diǎn)變異28例次，說(shuō)明替比夫定經(jīng)典耐藥發(fā)生率也較高。還有文獻(xiàn)報(bào)道80、180、181、229位點(diǎn)變異也與替比夫定變異有關(guān)[5]，本研究檢測(cè)到上述基因位點(diǎn)的變異率為24.07%。雖然目前替比夫定的耐藥率比拉米夫定低，但其耐藥率仍有進(jìn)一步升高的風(fēng)險(xiǎn)。

恩替卡韋作為目前抗HBV病毒的一線藥物，很少發(fā)生耐藥，其5年病毒耐藥率<1.2%[6]，這主要是因?yàn)槎魈婵f是在204+180位點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上發(fā)生耐藥的。此外有報(bào)道rtT184、rtS202位點(diǎn)也參與恩替卡韋耐藥的發(fā)生[7]。本研究檢測(cè)到180+204位點(diǎn)變異共27例次，其中恩替卡韋耐藥必需的180M+204V 位點(diǎn)變異14例次，180M+204V及I位點(diǎn)變異2例次，總共16例次，變異率僅為7.41%。另外有184位點(diǎn)變異3例次(2.00%)，202位點(diǎn)變異4例次(2.67%)，但它們不能單獨(dú)誘發(fā)恩替卡韋耐藥，故恩替卡韋的耐藥率很低，可作為臨床核苷(酸)類(lèi)似物中抗病毒治療的首選藥物。

替諾福韋酯的主要耐藥位點(diǎn)是rtA194T[8]，由于該藥尚未在國(guó)內(nèi)上市，本地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)該藥的天然耐藥病例。

總之，通過(guò)對(duì)本地區(qū)CHB病人核苷(酸)類(lèi)似物耐藥位點(diǎn)的分析，初步了解了本地區(qū)CHB病人HBV耐藥突變情況，可更好地指導(dǎo)臨床用藥。

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(本文編輯 厲建強(qiáng))

A RESISTANCE MUTATION ANALYSIS OF HBV IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS B IN XUZHOU AREA OF JIANGSU PROVINCE

ZHAOYubao,DINGQin,PANYu,WANGLi′na,ZHANGYanchao

(Department of Infectious Disease, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)

ObjectiveTo analyze the gene mutation site and genotyping distribution of hepatitis B virus (HBV) in patients with chronic hepatitis B (CHB) in Xuzhou area.MethodsThis study consisted of 216 patients with CHB treated in our hospital from May 2013 to November 2013. Employing combined Nucleic Acid Amplification Techniques with fluorescent labeling hybridization method, their serum HBV DNA was detected and HBV genotyping and resistance variation site were analyzed.ResultsAmong 216 patients, 207 cases (95.83%) were genotype C, nine (4.17%) were genotype B; virus variant was noted in 85 cases, and 131 cases with no variant, aberration rate being 39.35%; variation sites were rtV173, rtL180, rtA181, rtT184, rtS202, rtM204, rtV207, rtS213, rtV214, rtN236 and rtN238. In the mutable points, the detection rates in rtM204 and rtL180 were 21.30% and 13.89%, respectively. The mutation rates of lamivudin-, adefovir-, telbivudin-related virogene locus were 29.63%, 20.37%, 12.96%, respectively.ConclusionIn Xuzhou area, genotype C is more commonly seen in HBV genotype distribution, the mutation strains accounts for 39.35% in the strains detected. The detection rates are relatively higher in lamivudine-and adefovir-resistance points, but lower in entecavir-related point.

hepatitis B virus; genotype; mutation

2013-03-11;

2014-05-28

江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(08KJD-320012)，徐州醫(yī)學(xué)院研究生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(XYLC-1208)

趙玉寶(1988-)，男，碩士研究生。

丁芹(1970-)，女，博士，副主任醫(yī)師，副教授。Email：kgylan163@163.com。

R512.6

A

1008-0341(2015)02-0170-03