陶華平

（杭州師范大學(xué)浙江省器官發(fā)育與再生技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州310036）

0 引言

在脊椎動物發(fā)育過程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)起源于神經(jīng)板層.邊緣細(xì)胞分化形成神經(jīng)嵴細(xì)胞.在之后的胚胎發(fā)育過程中，廣泛遷移，產(chǎn)生了大部分的神經(jīng)元以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中所有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞.剩下的神經(jīng)板內(nèi)陷形成神經(jīng)管，隨后分化成大腦和脊髓.分子克隆的發(fā)展，熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)，以及轉(zhuǎn)基因和電穿孔技術(shù)的應(yīng)用，使得在神經(jīng)系統(tǒng)形成過程中，細(xì)胞水平乃至分子層面的事件為人們所了解.這些技術(shù)使我們能夠?qū)?xì)胞譜系、神經(jīng)束路進(jìn)行追蹤，從而精確揭示神經(jīng)細(xì)胞的遷移、增殖、分化以及神經(jīng)回路形成的過程，增加了我們對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程的認(rèn)識.

19世紀(jì)70年代，Nicole Le Douarin利用鵪鶉-雞做嵌合體進(jìn)行研究，使人們對神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移路徑和隨之衍生而來的區(qū)域劃分有了突破性的認(rèn)識.18世紀(jì)80年代早期，分子克隆技術(shù)在發(fā)育生物學(xué)達(dá)到了一個黃金發(fā)展時代.某些基因限制性的特異表達(dá)在特定神經(jīng)細(xì)胞中時，成為了非常寶貴的分子標(biāo)記［1］，使研究者可以清晰明確地辨別不同種類的神經(jīng)元以及同一種類神經(jīng)元的不同分化時期.19世紀(jì)90年代，就是綠色熒光蛋白GFP的應(yīng)用，以及隨后出現(xiàn)的多種顏色的熒光蛋白，使研究者可以用特異啟動子啟動熒光蛋白的表達(dá)以標(biāo)記特定細(xì)胞種群，使我們的觀察、拍照變得非常容易.由此，這些不同細(xì)胞類型以及不同發(fā)育階段的特異標(biāo)記物革命性地使得我們能夠?qū)崟r追蹤著發(fā)育的過程.

本文重在介紹基于上述發(fā)現(xiàn)建立起來的，目前常用的神經(jīng)示蹤技術(shù)及其特點.

1 染料注射示蹤

該方法是指利用能被細(xì)胞吸收并在軸漿、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)來顯影示蹤.此法由來已久，且染料類目眾多，不斷地更新?lián)Q代，目前仍被廣泛使用.

1.1 直接顯影類

主要指熒光染料.按屬性又可分為水溶性（漿染）和脂溶性（膜染），或者分為蛋白類和多糖類.

1.1.1 水溶性

例，快藍(lán)（fast blue，F(xiàn)B）.水溶性好，顆粒細(xì)，易被神經(jīng)軸索攝取，易從標(biāo)記細(xì)胞擴(kuò)散到周圍組織，標(biāo)記的神經(jīng)元胞體和纖維多于其他染料.缺點是經(jīng)熒光照射后淬滅快，即使低溫避光，仍不能長時間保存.不利于需要標(biāo)記后較長時間觀察的研究.

1.1.2 脂溶性

例，DiI和DiO 及其衍生物.屬于親脂性羰花青染料.通過在胞漿膜上橫向擴(kuò)散達(dá)到標(biāo)記的目的.是常用的順、逆行標(biāo)記物，激發(fā)光下呈現(xiàn)明亮的橘紅色.適用于活體和固定標(biāo)本.以DiI為例，由于高度親脂性，其在組織液中不易擴(kuò)散，能特異性標(biāo)記目的神經(jīng)元和突起，且對相鄰纖維影響小.無毒性，不會明顯影響攝取細(xì)胞生理功能.研究表明，DiI標(biāo)記可以在體外培養(yǎng)組織中維持至少4周，活體超過1年的時間.該類染料的優(yōu)點是染色速度快，固定組織0.2～0.6 mm／d，活體中6 mm／d.結(jié)合狀態(tài)穩(wěn)定，維持時間長不易降解；缺點是由于其膜染特性，無法或很難跨細(xì)胞、跨突觸標(biāo)記.Kulesa等利用DiI類染料追蹤研究展示了神經(jīng)嵴細(xì)胞完成它們的分型是一個腹側(cè)到背側(cè)的順序，也解釋很多的遷移行為的細(xì)節(jié)［2］.目前，這一染料已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)嵴細(xì)胞譜系追蹤、脊髓軸突投射追蹤等方面.

再例如，熒光金（fluoro gold，F(xiàn)G），常用的逆行示蹤劑，屬于慢速軸槳運(yùn)輸類染料.優(yōu)點是靈敏度高，運(yùn)輸和標(biāo)記的距離長，且只標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)不標(biāo)記細(xì)胞核，能很好顯示樹突分支，不會有細(xì)胞外的染料滲漏.不易擴(kuò)散，與周圍組織分界清晰，褪色慢，且可以經(jīng)受多種組織化學(xué)染色處理，因而可以與HRP、免疫組化等方法結(jié)合使用［3］.缺點是此染料在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在時間短，通常不超過3周［4］.相關(guān)研究如利用FG 研究視神經(jīng)纖維的分布路徑和走向［5］.

1.1.3 多糖類

例，羅丹明B（Rhodamine B），又稱玫瑰紅B，或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料.在溶液狀態(tài)下，受激發(fā)有強(qiáng)烈的桃紅色熒光.優(yōu)點是光穩(wěn)定性好，對PH 不敏感，波長寬，可用于多種激發(fā)光.缺點是熒光相對較弱，且經(jīng)老鼠試驗發(fā)現(xiàn)，羅丹明B 會引致皮下組織生肉瘤，被懷疑是致癌物質(zhì).

除上述以外，還有核黃素（nclear yellow，NY）、雙瞇基黃（diamidino yellow，DY）、臺朌藍(lán)（trypan blue，TB）等.

熒光染料的最大特點就是操作簡單，易于觀察和拍照，且同時注射多種不同特性和激發(fā)波段的熒光染料可實現(xiàn)雙標(biāo)或多標(biāo).但共同的缺點是熒光素通常分子量小，用于逆行追蹤時，注射部位易于擴(kuò)散，難以確定有效注射部位.另外，淬滅是熒光染料又一大缺點，即使在低溫、避光條件下，切片保存時間仍有限，因此要求實驗者在觀察和拍照時要盡量縮短時間.

1.2 間接顯影類

1.2.1 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidas，HRP）及其結(jié)合物，例如WGA-HRP，CB-HRP

HRP是一種含有血紅素基的植物糖蛋白.不僅能夠在活體，也能夠在固定后的組織中進(jìn)行順、逆行運(yùn)輸.早在1978年，來自耶魯大學(xué)的研究者們就用注射游離HRP來追蹤支配雞后肢肌肉運(yùn)動的運(yùn)動神經(jīng)元在脊髓中的分布［6］.為了提高靈敏度，有很多研究者對該法進(jìn)行了改進(jìn).Kristensson等將霍亂病毒B亞基結(jié)合到辣根過氧化物酶上（CB-HRP）用于追蹤周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的纖維聯(lián)系，創(chuàng)造了辣根過氧化物酶追蹤神經(jīng)元聯(lián)系的技術(shù).傳統(tǒng)二氨基聯(lián)苯胺（DAB）及之后改進(jìn)的TMB-ST 法顯影，增強(qiáng)了此法的簡便性、靈敏度和安全性［7-8］.HRP作為追蹤劑的優(yōu)點是無論順、逆行標(biāo)記都能取得較好的效果，偏向性較小.標(biāo)記的細(xì)胞和樹突結(jié)構(gòu)清晰.并且可以有條件地實現(xiàn)跨突觸標(biāo)記，追蹤細(xì)胞間聯(lián)系.缺點是顯影步驟繁瑣，顯色處理后，細(xì)胞失去了活性，無法進(jìn)行膜片鉗等神經(jīng)電生理研究，限制了HRP 的應(yīng)用.另外，HRP參與細(xì)胞代謝，無法長期存留，且其反應(yīng)產(chǎn)物較不穩(wěn)定，易丟失，所以HRP 在神經(jīng)逆行示蹤方面的應(yīng)用大大局限而減少.

1.2.2 生物素葡聚糖胺（BDA）

常用的HR 示蹤技術(shù)由于步驟繁瑣，且存在有效注射范圍難以確定、跨神經(jīng)元輸送、過路纖維等問題，限制了其應(yīng)用范圍.1986 年，Glover等首次應(yīng)用了生物素化葡聚糖胺（biotinylateddextran amine，BDA）追蹤神經(jīng)纖維的方向［9］.BDA 是一類雙向神經(jīng)示蹤劑［9-10］，常用來研究神經(jīng)元的分支投射示蹤.BDA 在細(xì)胞外注射后，可以被神經(jīng)元及其突起攝取，然后順行或逆行沿軸突轉(zhuǎn)運(yùn)至遠(yuǎn)處，經(jīng)過處理的神經(jīng)組織標(biāo)本采用ABC免疫組化染色，用抗生物素蛋白（Avidin）與標(biāo)記物中的生物素產(chǎn)生反應(yīng)，最終經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯影，即可顯示所標(biāo)記區(qū)域的神經(jīng)走向，相對于HRP與其他神經(jīng)示蹤劑，BDA 具有生物學(xué)性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)運(yùn)距離遠(yuǎn)，可以采用多種免疫組化或免疫熒光技術(shù)作顯影處理，能滿足光鏡及電鏡下觀察的要求等優(yōu)點.另外經(jīng)處理的BDA 標(biāo)記組織標(biāo)本保存時間長，可以保存6個月以上，且不影響最終顯影結(jié)果.缺點是BDA 通常情況下不被不受損神經(jīng)吸收，所以在注射時必須先切斷或損傷被標(biāo)記神經(jīng).

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)示蹤

指利用基因打靶和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記示蹤.該技術(shù)的特點：首先，在示蹤標(biāo)記物方面，內(nèi)源性遺傳物質(zhì)取代外源性，標(biāo)記發(fā)生于基因水平，能夠克服傳統(tǒng)標(biāo)記物的局限和缺點；其次，在標(biāo)記方式上，由“宏觀”的物理標(biāo)記法轉(zhuǎn)變?yōu)椤拔⒂^”的基因打靶標(biāo)記，從根本上解決了物理標(biāo)記過程造成細(xì)胞損傷以及隨著傳代標(biāo)記會被稀釋的問題；最后，在示蹤手段上，通過借助光學(xué)顯微鏡，實行活體示蹤和觀察，最大的好處就是能夠獲得高分辨率的照片.2013年，Kulesa等以轉(zhuǎn)基因GFP標(biāo)記某一種群的神經(jīng)嵴細(xì)胞［11-12］，研究其遷移過程、誰先誰后的細(xì)胞間相互作用以及不同時間的不同的發(fā)育潛能［13］.

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的示蹤分為瞬時示蹤和長效示蹤.

2.1 瞬時示蹤

主要指以病毒感染或電穿孔技術(shù)導(dǎo)入，使攜帶有示蹤基因，如綠色熒光蛋白（GFP）、β半乳糖苷酶（β-Gal、LacZ）等的目的質(zhì)粒在特定細(xì)胞內(nèi)瞬時表達(dá)，基因并不整合于基因組上.這一技術(shù)的缺點在于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是瞬時的，只能維持幾天至幾周時間，而非永久標(biāo)記.不利于長時程追蹤細(xì)胞譜系和神經(jīng)通路.

2.1.1 病毒感染

20世紀(jì)80年代，Kristensson將I型單純皰疹病毒（HerpessimplexvirustypeⅠ，HSV1）注射到小鼠腓腸肌，發(fā)現(xiàn)它能通過坐骨神經(jīng)感染脊神經(jīng)、背根節(jié)及脊髓背角；而將HSV1注入兔眼時，病毒順行感染視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞、中腦上丘和外側(cè)膝狀體.由此，病毒在神經(jīng)通路示蹤方面的應(yīng)用受到了越來越多的重視.目前常用的兩類病毒是腺病毒（adenovirus）、腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus，r AAV）和皰疹病毒.改造后的病毒帶有GFP或LacZ的表達(dá)基因，可用于被感染神經(jīng)的示蹤觀察.

腺病毒和腺相關(guān)病毒具有噬神經(jīng)性，能在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)繁殖并沿樹突和軸突進(jìn)行擴(kuò)散和運(yùn)動.由于病毒的復(fù)制增殖，所攜帶的標(biāo)記蛋白，如GFP便隨之到達(dá)神經(jīng)元的各個部位，包括軸突和其細(xì)小分支.經(jīng)固定和切片便能直接在熒光顯微鏡下觀察，也可經(jīng)免疫組化染色在光鏡下觀察；皰疹病毒也是具有復(fù)制能力的病毒，特點是親神經(jīng)性和跨神經(jīng)元傳遞，主要應(yīng)用于追蹤外周器官與中樞神經(jīng)系統(tǒng)間的聯(lián)系及內(nèi)部環(huán)路.常用的有假狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）和Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV1）.PRV 能沿特異的神經(jīng)通路跨突觸感染，并可用免疫組織化學(xué)法顯示PRV 感染的第二級神經(jīng)元.隨著動物存活期的延長，還能顯示第三級以上神經(jīng)元.HSV1與PRV 相似，均屬于DNA 病毒.

DNA 病毒作為示蹤劑，必須先進(jìn)行改造，將其中不為病毒生存、復(fù)制所必須的序列進(jìn)行加工、修飾產(chǎn)生變異減毒株，延長管注射動物的存活時間，以保證病毒進(jìn)行跨神經(jīng)元的長距離、長時間示蹤.另外，病毒的株型、活性和滴度都很關(guān)鍵.未來，利用基因工程技術(shù)對示蹤病毒進(jìn)行基因重組和改造，獲得新的病毒毒株應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞譜系和通路研究將會是主要方向.

2.1.2 電穿孔基因轉(zhuǎn)導(dǎo)

電穿孔技術(shù)是指利用DNA 帶負(fù)電荷的特點，在高電場作用下向正極移動，利用細(xì)胞膜的通透性，將外源分子導(dǎo)入細(xì)胞.使用BTX 等公司生產(chǎn)的電擊儀即可完成這一過程.

該技術(shù)能快速直接地使不同形式的重組質(zhì)粒在體內(nèi)表達(dá)，簡便性上大大超過了病毒載體，促使發(fā)育生物學(xué)研究取得了一系列的進(jìn)展.1999年，Akamatsu首先在從子宮取出的E8.25／E9的小鼠胚胎中實現(xiàn)了體內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)基因，觀察到了早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育情況［14］.這對于研究小鼠神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)決定、遷移、定位和軸突導(dǎo)向等神經(jīng)系統(tǒng)后期發(fā)育具有深遠(yuǎn)的意義.目前已經(jīng)開發(fā)出多種發(fā)育研究特用電極，如Genetrodes、L形狀針電極.許多研究人員已經(jīng)在鼠、斑馬魚、蟾蜍、果蠅的研究中應(yīng)用了此項技術(shù)，轉(zhuǎn)染了眼、心或者肢體組織.

該技術(shù)的一大優(yōu)勢是不影響動物存活，且能夠同時轉(zhuǎn)導(dǎo)多個基因，并能結(jié)合神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的時空特異性進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后短時間內(nèi)就能觀察.缺點是外源基因表達(dá)持續(xù)的時間較短，大多1～2月后表達(dá)量降至很低.代謝和酶活動旺盛的細(xì)胞尤為如此；另外，不同實驗組織、物種，首次實驗都需摸索條件：DNA狀態(tài)（例線性或環(huán)狀）、濃度、體積、電壓、波形、電穿孔次數(shù)和時間等都需優(yōu)化，才能形成穩(wěn)定的電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)體系.

2.2 長效示蹤

指的是遺傳性改變細(xì)胞的基因，使其表達(dá)特異性標(biāo)志物.主要指構(gòu)建Cre／loxp轉(zhuǎn)基因品系.Cre重組酶是一種位點特異性重組酶，特異識別loxp位點并介導(dǎo)位點間序列被刪除或重組，無需借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)DNA 底物，如線形、環(huán)狀，甚至超螺旋結(jié)構(gòu)，大致原理見圖1（修改自Zinyk 等［15］）.Joyner等最早應(yīng)用Cre／loxp 系統(tǒng)研究大腦發(fā)育過程中細(xì)胞譜系示蹤［15］.他們構(gòu)建了兩種轉(zhuǎn)基因小鼠：一種是在β-actin基因的啟動子后插入標(biāo)志基因LacZ，其表達(dá)被一段同向loxp錨定的“STOP”序列所抑制；另一種是在Engrailed2（En2）啟動子后插入Cre基因.兩種轉(zhuǎn)基因品小鼠雜交后，表達(dá)En2的細(xì)胞會產(chǎn)生Cre酶，進(jìn)而切除“STOP”序列，啟動標(biāo)志基因LacZ的表達(dá).利用該方法，Joyner等證實了En2陽性的細(xì)胞在小鼠中腦發(fā)育中的重要作用.

神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育伴隨著各類神經(jīng)細(xì)胞的分化，意味著特異性基因的表達(dá)，所以通過組織或細(xì)胞特異性啟動子啟動Cre重組酶的表達(dá)，以去除loxp位點間的抑制序列，從而激活受體基因，例如LacZ、GFP等，以此標(biāo)記所有帶該啟動子的細(xì)胞及其子代來達(dá)到示蹤的目的.目前已在斑馬魚［16-17］和小鼠中廣泛使用.

圖1 Cre／loxp原理Fig 1 Schematic diagram of Cre／loxp system

2012年，Rodrigue利用Sox10［16］，以及2013 年，Hochgreb-Hagele利用FoxD3［17］這些特異性啟 動子，長效地追蹤了神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化過程.同樣，在小鼠中，也常利用特異性啟動子啟動CRE 重組系統(tǒng)來追蹤周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)嵴細(xì)胞亞群.例如，利用Ngn1 標(biāo)記pd2［18］；Dbx1 標(biāo)記pd6，p0［19］；Oligo2標(biāo)記p MN［20］；Nkx2.2標(biāo)記p3區(qū)細(xì)胞［21］等.但用Cre／lox轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行研究需要注意一個問題，即該基因是否特異性地表達(dá)在該組織或細(xì)胞中，如若不是，在利用CRE 敲除，影響到該基因在別的組織中的表達(dá)或功能，那么，所得結(jié)果就得另有考慮，或重新評估.例如應(yīng)用最為廣泛的Wnt1-cre.有研究表明，Wnt1-cre小鼠品系有可能激活了中腦中的Wnt信號通路［22-23］.

最新基于CRE重組技術(shù)發(fā)展起來的，利用多熒光基因序列的隨機(jī)重組，產(chǎn)生出更多的顏色組合，即所謂的Rainbow［24］，Zebrabow［25］，，以達(dá)到更多熒光顏色同時示蹤多種神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移、分化、增殖過程，對神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)研究來說又是一大進(jìn)步.

建立轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行示蹤的最大優(yōu)點是克服了瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)時間短、不能傳代的弱點，使研究者能夠長效地對目的細(xì)胞及其后代進(jìn)行追蹤和觀察.缺點是構(gòu)建一個轉(zhuǎn)基因品系比較困難，從載體構(gòu)建到注射到細(xì)胞篩選到最終成為轉(zhuǎn)基因動物，耗時長，技術(shù)難度大且成功率低，目前適用的研究模型還比較局限.轉(zhuǎn)基因品系構(gòu)建成功后也僅限于某類帶特異性啟動子細(xì)胞的研究，相對局限，不如其他方法來的靈活多變.

3 結(jié)語

神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)的一個重要研究方向是揭示發(fā)育過程中，神經(jīng)前體細(xì)胞如何從它們原先產(chǎn)生的位置遷移到最終的目的地以及相互之間聯(lián)系的形成這一過程.種種證據(jù)顯示，是基因控制了這一切的發(fā)生［26］.但對于神經(jīng)前體細(xì)胞間存在什么樣的相互作用，以及它們所處的環(huán)境如何影響它們的命運(yùn)，我們還知之甚少.隨著高分辨率顯微鏡和多種熒光蛋白的應(yīng)用，雙光子顯微鏡的發(fā)展，優(yōu)質(zhì)的模式生物，如斑馬魚、秀麗隱桿線蟲，更多的基因操縱手段的發(fā)明，例如TALENS和CRISPR 技術(shù)都將應(yīng)用到神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究中，為我們解答這些未知給予希望.

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