潘圓未 平 鍵 張 晶 陳高峰 徐列明，3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所 (上海，20203) 2.上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

安琺特是復(fù)方牛胎肝提取物，臨床上可用于急、慢性肝病、脂肪肝及肝纖維化的輔助治療。文獻(xiàn)報(bào)道顯示其可以改善肝纖維化患者的肝功能、纖維化血清學(xué)指標(biāo)［1］，目前尚無安琺特對于改善DMN 所致肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。本研究采用DMN 腹腔注射構(gòu)建慢性肝纖維化模型，觀察安琺特對該模型的干預(yù)作用，為臨床應(yīng)用安琺特提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 Wistar 雄性大鼠29 只，體重(184 ±9)g，SPF 級，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號為SCXK(滬)2007-0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)藥物安琺特，批號121009，黑龍江江世藥業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)，Cat.No.MAL05，為東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品;羧甲基纖維素鈉，Sigma 公司產(chǎn)品，購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。二甲苯，甲醛，無水乙醇，分析純;中性樹膠，均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。蘇木素伊紅染料，羥脯氨酸測定試劑盒，均購自南京建成生物制品研究所。全自動(dòng)生化儀AU2700，為BECKMAN COULTER 公司產(chǎn)品。輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2035)、冰凍切片機(jī)(CM1850)、HI1210 恒溫水浴、HI1220 烤片機(jī)、LEICA ASP300 自動(dòng)脫水機(jī)、LEICA EG1160 石蠟包埋機(jī)，購自德國Leica 公司。Olympus BX40 光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司產(chǎn)品。連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國BIO-TEK 公司產(chǎn)品。

1.3 造模與用藥方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，采用分層隨機(jī)方法分為正常組9 只、模型組10 只、安琺特組10 只。后兩組大鼠用0.5%DMN 按2ml/kg 體重腹腔注射，首次注射全劑量的2/3，1次/d，連續(xù)注射3d 后休息4d，共4w。正常組大鼠在相同的時(shí)間和部位行腹腔注射等劑量的生理鹽水，共4w。

造模4w 后。安琺特組大鼠按照成人用藥量的8 倍劑量灌胃，1次/d，正常組和模型組大鼠灌胃等劑量的0.5%CMC，均4w。

1.4 樣本收集及指標(biāo)檢測 大鼠用藥4周后，禁食12h，20%烏來坦麻醉，下腔靜脈采血。血液4℃下靜置2h 后，3000rpm，15min 離心，取上清液分裝于1.5ml 離心管，-70℃低溫保存。動(dòng)物取血處死后，取下肝臟和脾臟稱重，然后取約1.0cm×0.8cm×0.3cm 大小肝組織2 塊，于10%中性甲醛溶液中固定，24h 后逐級酒精脫水，二甲苯透明，56℃石蠟包埋，4μm 切片，-70℃保留2 管肝組織用于羥脯氨酸(Hyp)測定。采用全自動(dòng)生化儀檢測血清ALT、AST、TBiL、γ-GT 和Alb。對肝組織切片進(jìn)行常規(guī)HE 染色及天狼猩紅染色，觀察其病理變化。肝組織Hyp 采用南京建成生物制品研究所強(qiáng)堿分解法試劑盒測定。

肝纖維化分級參照相關(guān)文獻(xiàn)［2］的半定量標(biāo)準(zhǔn)。膠原纖維增生程度的Ⅰ級:膠原纖維增生，中央靜脈和門靜脈區(qū)有少量星狀膠原纖維束放散，但無間隔形成。Ⅱ級:膠原纖維增生，中央靜脈和門靜脈區(qū)結(jié)締組織變厚，由此向四周形成纖維索，形成不完全間隔。Ⅲ級:膠原纖維大量增生，有個(gè)別菲薄的完全間隔形成，或較厚的不完全間隔即將形成假小葉。Ⅳ級:完全間隔較厚，假小葉大量形成。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腹水發(fā)生情況 造模4周結(jié)束時(shí)無大鼠死亡。部分大鼠明顯可見腹部膨大，有腹水形成，在模型組和安琺特組隨機(jī)解剖1 只大鼠，可見腹腔大量腹水，肝臟縮小，質(zhì)地變硬，提示造模成功。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死大鼠時(shí)，各組大鼠腹水發(fā)生情況見表1。

表1 各組大鼠腹水發(fā)生情況

2.2 各組大鼠肝重、脾重、肝體比及脾體比情況 見表2。

2.3 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果 見表3。

表2 各組大鼠體重、肝重、脾重情況比較()

表2 各組大鼠體重、肝重、脾重情況比較()

與正常組比較，* P＜0.05;與模型組比較，##P＜0.01

表3 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較()

表3 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較()

與正常組比較，* P＜0.05;與模型組比較，# P＜0.05

2.4 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞由中央靜脈向四周呈放射狀排列，無變性壞死，肝竇未見狹窄或擴(kuò)張;模型組大鼠肝臟內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，肝竇狹窄，匯管區(qū)擴(kuò)大，肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)腫脹、變性壞死，肝組織內(nèi)有明顯出血現(xiàn)象;與模型組相比，安琺特組大鼠的肝細(xì)胞變性壞死、出血、炎癥細(xì)胞浸潤等病理變化有不同程度的改善(見插頁圖1)。

天狼猩紅染色觀察:正常組大鼠肝臟僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見少量膠原纖維;模型組大鼠肝臟膠原增生明顯，大量纖維間隔向肝小葉伸展，分割包繞肝組織，形成假小葉;安琺特組大鼠肝臟纖維化程度較模型組明顯改善(見插頁圖2)。

2.5 各組大鼠肝組織纖維化及羥脯氨酸栓測結(jié)果 見表4。

表4 各組大鼠肝纖維化分級及羥脯氨酸檢測結(jié)果比較(，n)

表4 各組大鼠肝纖維化分級及羥脯氨酸檢測結(jié)果比較(，n)

與正常組比較，* P＜0.05;與模型組比較，# P＜0.05

表4 所示為肝纖維化等級評分情況，Ridit 分析可見，安琺特組較模型組肝纖維化明顯好轉(zhuǎn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。肝組織羥脯氨酸含量測定結(jié)果與天狼猩紅染色結(jié)果一致。

3 討論

安琺特是復(fù)方牛胎肝提取物，含有小分子多肽、維生素、肌醇等多種物質(zhì)。人體內(nèi)的細(xì)胞因子是一組功能信號肽，它們都具有各自的生物學(xué)活性，彼此之間在誘生、受體調(diào)節(jié)和生物學(xué)效應(yīng)3個(gè)水平上相互作用，構(gòu)成一個(gè)內(nèi)含豐富、關(guān)系復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。在肝纖維化早期，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)可能是重要的，若調(diào)節(jié)失常則引致肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。牛胎肝提取物中含有多種肝纖維化抑制因子相關(guān)多肽，可在人肝細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)大的生物學(xué)活性，通過細(xì)胞因子的多效性和協(xié)同性充分發(fā)揮細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用，完成其拮抗肝纖維化發(fā)生的調(diào)節(jié)功能［2］。本實(shí)驗(yàn)中，觀察到安琺特在DMN 所致的大鼠肝纖維化模型中發(fā)揮了良好的抗肝纖維化作用。安琺特能降低肝纖維化大鼠的腹水發(fā)生率，改善肝功能，降低肝組織膠原含量，組織病理學(xué)可見安琺特組大鼠肝組織纖維化程度明顯減輕。而安琺特是如何通過調(diào)節(jié)自身的肝纖維化抑制因子從而發(fā)揮抗肝纖維化的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

目前，安琺特在臨床上可用于多種慢性肝病、肝纖維化的輔助治療，文獻(xiàn)報(bào)道顯示其有良好的抑制肝纖維化作用。張力等采用干擾素聯(lián)合安琺特用于乙型肝炎的治療，36周療程結(jié)束后，患者血清肝纖維化指標(biāo)改善方面明顯優(yōu)于單用干擾素的對照組，肝組織病理亦證實(shí)聯(lián)合用藥可使肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度明顯好轉(zhuǎn)，提示聯(lián)合用藥可顯著提高抗肝纖維化療效［3］。安琺特不僅能輔助抗病毒藥物治療乙型肝炎肝硬化，與其他抗肝纖維化中藥制劑聯(lián)合使用，也能取得好療效，孟勝喜等應(yīng)用軟肝丸聯(lián)合安琺特用于乙型肝炎肝纖維化的治療，結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合可明顯緩解患者的臨床癥狀，改善肝功能，降低血清肝纖維化指標(biāo)［4］。

也有研究人員針對該藥進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。蔡衛(wèi)民等復(fù)制四氯化碳大鼠肝纖維化模型，應(yīng)用安琺特進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示安琺特可明顯降低大鼠死亡率、改善肝臟功能和降低肝纖維化程度［5］。而本課題利用DMN 復(fù)制大鼠肝纖維化模型，DMN 模型的特點(diǎn)是造模時(shí)間短，肝纖維化形成穩(wěn)定，與人類肝纖維化早期改變及膠原纖維沉積特點(diǎn)相似，停止染毒后不易自行吸收恢復(fù)［6］。本實(shí)驗(yàn)成功地復(fù)制了穩(wěn)定可靠的肝纖維化模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明安琺特可明顯降低肝纖維化大鼠的肝組織膠原含量，組織病理學(xué)可見安琺特組大鼠肝組織纖維化程度明顯減輕，同時(shí)可減少肝纖維化大鼠的腹水發(fā)生率。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:安琺特對DMN 所致的慢性實(shí)驗(yàn)性肝纖維化具有良好的干預(yù)作用，為臨床應(yīng)用安琺特治療慢性肝病肝纖維化提供了有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］崔建軍，范平，王松，等.安琺特與軟肝片抗肝纖維化的比較觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2006，16(3):177 -178.

［2］王憲波，劉平，唐志鵬，等.蟲草菌絲提取物干預(yù)與治療二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，28(07):617 -622.

［3］張力，任曉華，李敏然，等.干擾素-α1b 聯(lián)合安琺特治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床研究［J］.河北醫(yī)藥，2008，30(10):1560.

［4］孟勝喜.軟肝丸聯(lián)合復(fù)方牛胎肝提取物片治療慢性乙型肝炎肝纖維化療效觀察［J］.光明中醫(yī)，2009，24(7):1343 -1344.

［5］蔡衛(wèi)民，陶君，張彬彬，等.復(fù)方牛胎肝提取物片抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華肝臟病雜志，2004，12(8):499.

［6］鄺勝利，胡兵.肝纖維化大鼠模型研究進(jìn)展［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2008，28(1):62 -66.