陳 軼，陳益耀，蔡蔓妮，巫華志

miR-122在非酒精性脂肪肝病患者血清中的表達(dá)及其臨床意義

陳 軼，陳益耀，蔡蔓妮，巫華志

目的 探討microRNA-122(miR-122)在非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)患者血清中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)健康人、高脂血癥患者、非酒精性單純性脂肪肝(non-alcoholic simply fatty liver，NAFL)及非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)患者血清中miR-122的表達(dá)。結(jié)果 各組miR-122的表達(dá)水平分別為5.94±1.21(2-ΔΔCt)，5.99±1.03(2-ΔΔCt)，8.67±0.72(2-ΔΔCt)，10.55±0.83(2-ΔΔCt)。高脂血癥患者和健康人血清中miR-122的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與前兩組相比，NAFL和NASH患者血清中miR-122的表達(dá)明顯逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 非酒精性脂肪肝病患者血清中miR-122的表達(dá)量明顯升高，提示miR-122參與了非酒精性脂肪肝的形成及進(jìn)展過(guò)程，可作為診斷和評(píng)估組織學(xué)病變嚴(yán)重性的一種新的生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)有望成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

非酒精性脂肪性肝??；脂肪代謝；早期診斷；miR-122；

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD) 是一種無(wú)過(guò)量飲酒史、以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，發(fā)病與胰島素抵抗、脂代謝紊亂、糖代謝紊亂等密切相關(guān)[1]。脂代謝紊亂是胰島素抵抗的最早表現(xiàn)和重要特征。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-122在肝臟中高度表達(dá)[2]，同時(shí)與肝臟脂代謝有密切關(guān)系[3,4]，故探討miR-122與NAFLD的關(guān)系，有望進(jìn)一步探明NAFLD的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 非酒精性脂肪肝病及高脂血癥患者的血清標(biāo)本均來(lái)源于海南省人民醫(yī)院2012-10至2014-02門診及住院的患者。健康者血清標(biāo)本來(lái)自同期我院體檢中心行健康體檢的人員。非酒精性脂肪肝病的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2010年修訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[5]。高脂血癥患者的診斷參照國(guó)內(nèi)2007年發(fā)布的 《中國(guó)成人血脂異常防治指南》[6]標(biāo)準(zhǔn)，且膽固醇及三酰甘油均升高，行影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)脂肪肝。120例中，男76例，女44例，年齡19～69歲。共分4組：A組為30例健康者；B組為30例高脂血癥患者；C組為30例非酒精性單純性脂肪肝患者；D組為30例非酒精性脂肪性肝炎患者。

1.2 方法

1.2.1 血漿處理及RNA提取 外周靜脈血2 ml離心吸取上層血漿，取100 μl，依據(jù)異丙醇沉淀法提取RNA步驟，離心后加入20 μl ddH2O 溶解RNA。

1.2.2 miRNA 反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 按照miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒(TIANGEN公司)說(shuō)明書步驟進(jìn)行miRNA 反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min； 然后以94 ℃ 20 s和60 ℃ 34 s 進(jìn)行35～40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。以miR-16作為內(nèi)參照。Real-time 分析采用2-ΔΔCt法[7]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成。

2 結(jié) 果

2.1 miR-122的相對(duì)表達(dá)水平 A組：5.94±1.21(2-ΔΔCt)；B組：5.99±1.03(2-ΔΔCt)；C組：

8.67±0.72(2-ΔΔCt)；D組：10.55±0.83(2-ΔΔCt)。

2.2 各組中miR-122的相對(duì)表達(dá)水平的比較 A組與B組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

MicroRNAs(miRs)為一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸、保守的非編碼小RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后可抑制靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮重要作用[8]；它與生物的發(fā)育進(jìn)程、細(xì)胞生長(zhǎng)分化和凋亡、器官形成等生命活動(dòng)過(guò)程密切相關(guān)[9]。miRs的功能失調(diào)可能會(huì)引起癌癥、心血管疾病和代謝性疾病等。miR-122是miRs家族成員之一，其在肝臟的表達(dá)大約占肝臟miRs總量的70%[2]，它能夠促進(jìn)膽固醇和脂肪酸合成，抑制膽汁酸和脂肪酸氧化等[10-12]，提示miR-122在肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控中發(fā)揮廣泛作用。Esau等[4]的研究將miR-122特異性阻斷，發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控脂代謝的基因表達(dá)下調(diào)，其中關(guān)鍵酶磷酸甲羥戊酸激酶基因表達(dá)下調(diào)尤為明顯；在高脂喂養(yǎng)的小鼠中，沉默miR-122可導(dǎo)致肝脂肪變性的改善、膽固醇合成率降低以及膽固醇氧化增強(qiáng)。Krützfeldt等[13]發(fā)現(xiàn)，沉默miR-122 可導(dǎo)致血漿膽固醇水平顯著降低，推測(cè)可能與膽固醇生物合成基因表達(dá)降低有關(guān)?？梢?，miR-122是肝臟膽固醇和脂肪代謝的重要調(diào)控者。

本研究結(jié)果顯示，與健康人群比較，高脂血癥組患者血清中miR-122的表達(dá)無(wú)明顯差異；但在NAFLD患者中，其表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)，而且隨著病情的進(jìn)展，表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)：非酒精性脂肪性肝炎組患者血清中miR-122的表達(dá)明顯高于單純性脂肪肝組患者。也就是說(shuō)，單純血液中三酰甘油及膽固醇升高時(shí)，miR-122的表達(dá)并未發(fā)生明顯變化，但隨著肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積，miR-122的表達(dá)明顯升高，并與NAFLD病變的程度呈正相關(guān)。

可見，miR-122參與了非酒精性脂肪肝的形成及進(jìn)展過(guò)程，因而它可作為早期診斷和評(píng)估組織學(xué)病變嚴(yán)重性的一種新的生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)有望成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

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(2014-05-17收稿 2014-10-21修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Expression of miR-122 in nonalcoholic fatty liver disease and its clinical significance

CHEN Yi, CHEN Yiyao, CAI Manni, and WU Huazhi.

Department of Gastroenterology, Hainan Provincial People’s Hospital，Haikou 570311,China

Objective To analyze the expression levels of serum microRNA-122 (miR-122) in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) patients, and its clinical significance. Methods Patients with normal liver, hyperlipidemia, non-alcoholic simply fatty liver(NAFL),non-alcoholic steatohepatitis(NASH)were included in this study. Blood samples of the patients were collected for analysis. Real time quantitative PCR technique was used to measure the expression level of serum miR-122. Results The expression levels of serum miR-122 was 5.94±1.21(2-ΔΔCt),5.99±1.03(2-ΔΔCt),8.67±0.72(2-ΔΔCt)and 10.55±0.83(2-ΔΔCt),respectively. The difference in the expression level between normal liver and hyperlipidemia patients was not statistically significant. Comparing with normal liver and hyperlipidemia patients, miR-122 presented higher expressions in NAFL patients(P<0.05)，especially in NASH patients. Conclusion miR-122 plays an important role in NAFLD development and has early diagnostic value for indicating NAFLD. It may also be a potential therapeutic target in NAFLD with significant clinical value.

NAFLD; fatty acid metabolism; early diagnosis;miR-122

陳 軼，本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師， E-mail: 13807631989@163.com

570311?？?，海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科

通迅作者：陳益耀，E-mail: chenyiyao2008@163.com

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