黃 會(huì)，趙香依，吳多榮，姚 敏

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?570208；2.樂(lè)東縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 樂(lè)東 572500)

熒光定量PCR檢測(cè)女性生殖道解脲脲原體原體的應(yīng)用評(píng)價(jià)

黃 會(huì)1，趙香依2，吳多榮1，姚 敏1

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?570208；2.樂(lè)東縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 樂(lè)東 572500)

目的 了解熒光定量PCR檢測(cè)解脲脲原體（Uu）敏感性、特異性及其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法收集?？谌嗣袷嗅t(yī)院2013年3～5月婦產(chǎn)科門(mén)診泌尿生殖道感染患者生殖道標(biāo)本共154例，同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR和液-固體培養(yǎng)法檢測(cè)Uu，以液-固體培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)熒光定量PCR診斷試驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果154例標(biāo)本中，液-固體培養(yǎng)法即金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)陽(yáng)性64例，熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性69例，兩者同時(shí)陽(yáng)性63例，同時(shí)陰性84例，熒光定量PCR檢測(cè)Uu敏感性是98.44%(63/64)，特異性是93.33%(84/90)，假陽(yáng)性率是6.67%(6/84)，假陰性率是1.56%(1/64)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是91.30%(63/69)，陰性預(yù)測(cè)值是98.82%(84/85)，總符合率是95.45% (147/154)。χ2檢驗(yàn)顯示，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，計(jì)算Kappa>0.75，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性程度較好。結(jié)論熒光定量PCR方法具有靈敏度高、特異好、檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)，且與培養(yǎng)法一致性也較高，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

熒光定量PCR；解脲脲原體；應(yīng)用

解脲脲原體(Uu)是1954年Shepard首先從非淋球性菌尿道炎患者的尿道分泌物中分離獲得，是人類(lèi)泌尿生殖道最常見(jiàn)的寄生菌之一，在特定的環(huán)境下可以治病，主要引起生殖道和泌尿道炎癥，臨床上女性表現(xiàn)為尿道炎、陰道炎、輸卵管炎、子宮內(nèi)膜炎、不孕、異位妊娠等[1-2]。近年來(lái)Uu引起的泌尿生殖道感染有增多趨勢(shì)，相關(guān)的耐藥性報(bào)道不斷增加[3-6]，因此檢測(cè)方法逐漸引起人們的重視。液-固體培養(yǎng)法靈敏度強(qiáng)、特異性高，準(zhǔn)確性好，被公認(rèn)為檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]，但檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)，檢驗(yàn)要求高，操作步驟繁瑣，故不被臨床廣泛應(yīng)用，多數(shù)應(yīng)用于科研。熒光定量PCR是近幾年發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，因其靈敏度好，檢測(cè)時(shí)間短而越來(lái)越受到青睞。本研究以液-固體培養(yǎng)作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，考察熒光定量PCR的敏感性及特異性，探討熒光定量PCR的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 本試驗(yàn)標(biāo)本來(lái)源于海口市人民醫(yī)院2013年3～5月154例泌尿生殖道感染的婦產(chǎn)科門(mén)診患者。由門(mén)診醫(yī)生采集女性生殖道標(biāo)本，采集后的標(biāo)本立即送檢，熒光定量PCR檢測(cè)的送往PCR室，培養(yǎng)檢測(cè)的送往微生物室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 熒光定量PCR試劑、儀器 熒光定量PCR試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，儀器采用Line gene熒光定量PCR儀，試劑均在有效期內(nèi)使用，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.1.3 培養(yǎng)基 10B肉湯和A8瓊脂平板由法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 液-固體培養(yǎng)法 將標(biāo)本分別接種于10B肉湯和A8瓊脂平板。肉湯培養(yǎng)溫度35℃，大氣環(huán)境，瓊脂平板置于5%CO2的環(huán)境。接種后的肉湯每天兩次觀察顏色改變，1～4 d出現(xiàn)由黃變紅產(chǎn)堿改變時(shí)，檢查原種的瓊脂平板是否有菌落生長(zhǎng)，如果沒(méi)有，迅速轉(zhuǎn)接種變色的肉湯至瓊脂平板，每天檢查原種和轉(zhuǎn)種的瓊脂平板，A8瓊脂平板在接種后1～3 d出現(xiàn)的圓形棕色菌落，直徑在10～100 μm，判斷為解脲脲原體[8]。

1.2.2 熒光定量PCR方法 將送檢標(biāo)本插入裝有1.5 ml滅菌生理鹽水的離心管中，充分震蕩混勻，擠干，12 000 rpm離心5 min；去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1 ml混勻，12 000 r/min離心5 min；去上清，沉淀加入50 μlDNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min；12 000 r/min離心5 min，備用；陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品管各加入等量DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min，離心備用。取PCR反應(yīng)管若干，分別加入處理后的標(biāo)本(陰性、陽(yáng)性質(zhì)控品)上清液2μl，8 000 r/min離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽，待分析結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果：增長(zhǎng)曲線(xiàn)程S型曲線(xiàn)；陰性結(jié)果：如果增長(zhǎng)曲線(xiàn)不呈S型曲線(xiàn)則實(shí)驗(yàn)結(jié)果判為樣品的DNA含量＜5.0×102基因拷貝。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行配對(duì)設(shè)計(jì)的McNemer χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，計(jì)算Kappa值，評(píng)價(jià)兩種方法一致性程度。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR與液-固培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果比較 熒光定量PCR與培養(yǎng)法同時(shí)檢測(cè)154例標(biāo)本，其中熒光定量PCR檢出Uu陽(yáng)性69例，陰性85例；培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性64例，陰性90例：兩者同時(shí)陽(yáng)性63例，同時(shí)陰性84例，有6例經(jīng)培養(yǎng)法檢出陰性而PCR檢出陽(yáng)性，有1例經(jīng)培養(yǎng)檢出陽(yáng)性而PCR檢出陰性。兩種方法檢測(cè)結(jié)果經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。計(jì)算Kappa=0.907>0.75，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性較好。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)Uu的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果 敏感性(Sen)=63/(63+1)×100%=98.44%；特異性(Spe)=84/(84+6)×100%=93.33%；假陽(yáng)性率(FPR)=6/ (6+84)×100%=6.67%；假陰性率(FNR)=1/(1+63)× 100%=1.56%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值PV+=63/(63+6)×100%=91.30%；陰性預(yù)測(cè)值PV-=84/(84+1)×100%=98.82%；總符合率=(63+84)/(63+6+1+84)×100%=95.45%。

3 討論

熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)興起的檢測(cè)技術(shù)，該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，時(shí)間較短，能夠?qū)χгw進(jìn)行定量，逐漸被大型綜合性醫(yī)院廣為應(yīng)用[9-11]，但其檢測(cè)效果尚需進(jìn)一步的臨床評(píng)價(jià)。本研究以液-固體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)熒光定量PCR診斷試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。PCR與培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性分別69例和64例，同時(shí)陽(yáng)性63例，同時(shí)陰性84例，其中有6例經(jīng)培養(yǎng)法檢出陰性而PCR檢出陽(yáng)性，有1例經(jīng)培養(yǎng)檢出陽(yáng)性而PCR檢出陰性，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P>0.05，表明熒光定量PCR與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與周才麗等[12]和王玉珍等[13]的報(bào)道一致。對(duì)于評(píng)價(jià)兩種方法的一致性，Kappa=0.907>0.75，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一致性較好。熒光定量PCR敏感性為98.44%，特異性為93.33%，說(shuō)明其敏感性高，特異性好?？偡下蕿?5.45%，總符合率又稱(chēng)為總的正確率，總正確率越大，說(shuō)明其靈敏度和特異度之和越高，假陽(yáng)性與假陰性之和越小。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為91.30%，陰性預(yù)測(cè)值為98.82%，假陽(yáng)性率既誤診率6.67%，可能原因：一是PCR擴(kuò)增引物特異性不強(qiáng)，擴(kuò)增出無(wú)關(guān)的相似核苷酸序列；二是標(biāo)本污染了目標(biāo)DNA序列；三是6例假陽(yáng)性患者可能是經(jīng)治療后培養(yǎng)顯示已轉(zhuǎn)陰性，而PCR方法能檢測(cè)出死的病原菌。假陰性率既漏診率為1.56%，可能原因：一是標(biāo)本中含有DNA擴(kuò)增的抑制劑；二是裂解液中蛋白酶K濃度低；三是標(biāo)本處理或模板制備過(guò)程導(dǎo)致模板丟失。

臨床診斷Uu多數(shù)采用液體培養(yǎng)基結(jié)合藥敏試驗(yàn)判斷結(jié)果，這種方法易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且存在較為嚴(yán)重的污染問(wèn)題[14]，確切的診斷需要接種于固體培養(yǎng)基并見(jiàn)到UU菌落，該方法是被公認(rèn)為檢測(cè)Uu的“金標(biāo)準(zhǔn)”。試驗(yàn)中經(jīng)液體培養(yǎng)變紅色的86例，轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)后僅有82例出現(xiàn)Uu菌落，這提示我們培養(yǎng)物顏色的改變也不一定都是支原體，可能是其他微生物如變形桿菌、腸桿菌、克雷伯氏菌和酵母菌等污染所致假陽(yáng)性結(jié)果，在平時(shí)的工作應(yīng)注意標(biāo)本污染導(dǎo)致的假陽(yáng)。

綜上所述，熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問(wèn)題，減少了污染，且與液-固體培養(yǎng)法一致性較好，能對(duì)臨床快速診斷Uu提供很大幫助，在臨床工作中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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Application of fluorescence quantitative PCR for detection of Ureaplasma urealyticum in female genital tract.

HUANG Hui1,ZHAO Xiang-yi2,WU Duo-rong1,YAO Ming1.1.Department of Clinical Laboratory,Haikou Hospital Affiliated to Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Ledong County,Ledong 572500,Hainan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the sensitivity,specificity,and application of fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)for detection of Ureaplasma urealyticum(Uu)in female genital tract.MethodsA total of 154 specimens of patients with genital tract infections were detected by FQ-PCR and liquid-solid culture at the same time.All specimens were collected in Haikou People's Hospital from March 2013 to May 2013.ResultsIn the 154 specimens, 64 and 69 samples were revealed as positive according to the golden standard method and FQ-PCR method respectively,with 63 samples positive and 84 negative for both the golden standard method and FQ-PCR method.For FQ-PCR, the sensitivity rate was 98.44%(63/64),and the specificity rate was 93.33%(84/90),with the false positive rate of 6.67%(6/84),the false negative rate of 1.56%(1/64),positive predictive value of 91.30%(63/69),negative predictive value of 98.82%(84/85),and the total coincidence rate of 95.45%(147/154).χ2test results showed that there was nostatistical significant difference between the results of the two methods(P>0.05),and the consistency was good(Kappa>0.75).ConclusionFQ-PCR has the advantages of high sensitivity,good specificity,rapid detection,and high consistency with culture,and thus has certain clinical application value.

Fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR);Ureaplasma urealyticum;Application

R711.3

A

1003—6350（2015）18—2720—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0987

2015-01-28)

黃 會(huì)。E-mail：19599948@qq.com