付漢東，張愛華，劉漢忠，袁岸龍，魏 威 (湖北省孝感孝感市中心醫(yī)院/華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬孝感醫(yī)院：.中心實驗室；.普外科；.病理科；.消化內科，湖北孝感 000)

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·論 著·

Dermokine-β mRNA在結腸癌組織中的水平及臨床意義*

付漢東1，張愛華2，劉漢忠3，袁岸龍4，魏 威1
(湖北省孝感孝感市中心醫(yī)院/華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬孝感醫(yī)院：1.中心實驗室；2.普外科；3.病理科；4.消化內科，湖北孝感 432000)

目的 研究Dermokine(DK)-β mRNA在結腸癌組織中的水平和臨床價值。方法 采用RT-PCR法檢測DK-β mRNA相對水平，對結腸癌患者、結腸息肉、潰瘍性結腸炎患者以及健康對照組DK-β mRNA相對水平進行比較，對結腸癌不同臨床參數間DK-β mRNA相對水平進行比較，并進行統(tǒng)計學分析。結果 結腸癌患者DK-β mRNA表達比結腸息肉、潰瘍性結腸炎患者以及健康對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；但與患者年齡、性別、腫瘤的位置、大小無相關性，在低分化腺癌、Dukes分期B 期、有淋巴結轉移的患者中DK-β mRNA表達更明顯(P<0.05)。結論 結腸癌DK-β表達與結腸癌患者黏膜上皮細胞受損密切相關，B 期DK-β表達呈顯著升高，因此結腸組織DK-β水平檢測可作為結腸癌早期診斷的指標，對臨床結腸癌早期診斷有一定價值。

結腸癌； DK-β； mRNA

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，在我國已成為發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一[1]，由于目前結腸癌的早期診斷水平較低，約1/3的患者明確診斷時疾病已處于進展期[2]，因此結腸癌的延誤診斷是影響診斷和預后的重要原因[3]。Dermokine(DK)是結直腸上皮細胞角化后分泌的一種多肽,主要是縮氨酸，目前研究顯示DK至少有13種不同的亞型[4]，其中DK-β在早期結腸癌患者血清中的水平是呈顯著升高的[5]。作者通過檢測結腸癌組織中DK-β mRNA的相對水平變化來研究DK-β對國內人群早期結腸癌診斷的價值?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1～9月在本院住院治療的結腸癌患者30例，其中男18例，女12例；年齡26～81歲，參照文獻[6]按年齡分：≥60歲的老年患者14例，41～59歲的中年患者13例，≤40歲的青年患者3例；以腫瘤大小5 cm為臨界值[6](CT或MRI測量直徑，多個腫瘤時取直徑最大者)：≥5 cm 16例，<5 cm 14例；腫瘤部位：升結腸癌11例，橫結腸癌2 例，降結腸癌4例，乙狀結腸癌13例；淋巴結轉移：有13例，無17例；病理組織學分級：高分化腺癌4例，中分化腺癌12例，低分化腺癌11例，黏液腺癌3例，Dukes分期：A期6例，B期12例，C期8例，D期4例；以上病例勻符合病理學結腸癌診斷標準[7]。同期從門診和住院結腸息肉和潰瘍性結腸炎(UC)患者中各隨機抽取20例作為對照，每組中男12例、女8例，年齡20～67歲、平均45.6歲。同時從同期健康體檢人群中抽取30例作為健康對照組,其中男18例、女12例，年齡18～65歲、平均44歲。

1.2 標本采集 手術取患者腫瘤及周圍組織，癌旁正常組織為距腫瘤邊緣5 cm以上的腸段組織(病理證實腫瘤標本切緣腫瘤細胞殘留均為陰性)，對照組在腸鏡下取結腸息肉和炎癥組織，健康對照組在腸鏡下取少許結腸組織，快速切取組織，用預冷的1×PBS 液沖洗。放置于無RNA酶的凍存管中，保存于-86 ℃冰箱中待檢。

1.3 試劑與儀器 試劑：反轉錄試劑盒(美國Sigma公司)，總RNA提取試劑盒(美國Sigma公司)，β-actin 基因試劑盒(美國Sigma公司)，瓊脂糖(美國Invitrogen公司)，Taq DNA聚合酶(上海華美公司)，二乙基焦磷酰胺(DEPC)，液氮，無水乙醇、氯仿、溴化乙啶等。引物設計如下，DK-β上游引物:5′-ATGAAGCCGGCCACTGCCTCTG-3′,下游引物:5′-GCAGGCCAGGTTGCACCCGGG-3′，擴增范圍379 bp;β-actin上游引物:5′-TCATGAAGTGTGACGTGGACAT-3′,下游引物:5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′,擴增范圍158 bp(鄭州美博公司)。儀器:TC9600-G-230V型MultiGene梯度PCR儀(美國Labnet公司)，DYCZ-21型電泳儀(北京六一儀器廠)，Tanon-3500凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能公司)，TG328型電子天平(上海上天公司)，TGL-16M高速低溫離心機(湖南湘儀公司)，YQ-3型電動勻漿機(華城開元實驗儀器廠)，移液器(芬蘭Biohit公司)等。檢測中所有操作嚴格按試劑和儀器說明書要求進行。

1.4 組織RNA提取 用Trizol法提取組織中的總RNA，RNA的提取、完整性、純度及濃度檢測操作程序嚴格按試劑盒說明書要求進行，經質量檢測RNA的完整性、純度及濃度均符合要求后方可用擴增。

1.5 擴增和電泳 反應體系Ⅰ：Rnasin 1 μL，RT-PCR緩沖液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，反轉錄酶1 μL，OligodT 1 μL，RNA 4 μL，加無RNase滅菌蒸餾水至20 μL。把反應體系Ⅰ放在PCR儀反應孔中，設置反應模式。循環(huán)模式：37 ℃反轉錄60 min，得到cDNA。反應體系Ⅱ：RT-PCR緩沖液2 μL，dNTPs 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶 1.5 U，cDNA 2 μL，PCRTye 2 μL，加無RNase滅菌蒸餾水至20 μL。循環(huán)模式：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存待凝膠電泳檢測。電泳：將6 μL擴增產物與2 μL溴酚藍上樣緩沖液混合，在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，恒壓80 V，30 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.6 結果判斷標準 凝膠成像儀觀察結果，進行面積灰度掃描，DK-β mRNA相對表達量A值= DK-β mRNA產物的吸光度A值(OD)/β-actin產物的吸光度A值(OD)。

2 結 果

2.1 各組DK-βmRNA相對水平 結腸癌患者DK-βmRNA相對水平為0.82±0.46，比結腸息肉(0.34±0.16)、潰瘍性結腸炎(0.29±0.18)、健康對照組(0.14±0.11)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；結腸息肉與潰瘍性結腸炎間DK-βmRNA相對水平無明顯差異，但均比健康對照組高(P<0.05)。

2.2DK-βmRNA相對水平與結腸癌患者臨床病理參數的關系 見表1。DK-βmRNA的表達與患者年齡、性別、腫瘤的位置與大小無關，在不同組織學分級中低分化腺癌DK-βmRNA表達更明顯(P<0.05),不同Dukes分期中B期表達更明顯(P<0.05),有淋巴結轉移的比無淋巴結轉移表達更明顯(P<0.01)。

表1 DK-β mRNA相對水平與結腸癌患者臨床病理參數的關系

3 討 論

目前研究顯示DK位于人類染色體19q13.12上，是由一定數量的表皮特異基因組成[8]。DK至少有13種亞型，可編碼10多種不同的蛋白質，其中β型(相對分子質量45×103)擁有自己的啟動子，并在表皮細胞上表達，DK-β是以高度分化的上皮細胞層分層分泌的形式表達的[4]。炎癥條件下相關組織的上皮細胞的DK基因表達是有差異的，這種差異性也促進炎癥狀態(tài)的差異性[9]。研究表明在上皮細胞層廣泛受損中存在DK-β的高水平表達[10]。

本研究顯示結腸癌患者DK-βmRNA相對水平均比結腸息肉、潰瘍性結腸炎、健康對照組明顯升高(P<0.01)。結腸黏膜上皮細胞是通過細胞橋粒連接呈相互嵌合緊密排列的，其間隙由膜被顆粒排出物充填，使結腸黏膜具有獨特的生物學特性[11]，結腸黏膜上皮受到損傷可形成潰瘍性結腸炎，導致黏膜上皮細胞角化，黏膜組織發(fā)生異型增生，同時潰瘍性結腸炎中炎癥上皮細胞Bcl-2表達增高，炎癥細胞凋亡停止或減慢，造成潰瘍性結腸炎中大量炎癥細胞浸潤腸壁和持續(xù)活化[12]，從結腸息肉、潰瘍性結腸炎發(fā)展到結腸癌，是一個長期的過程，在早期發(fā)生APC基因突變，中期發(fā)生ras基因突變，晚期發(fā)生p53突變，最終導致癌變[13]，在此過程中伴有黏膜組織的異型增生和炎癥的長期存在，導致結腸黏膜上皮細胞層長期廣泛受損，DK-β表達也逐漸升高。由于NF-κB、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(INF-γ)和一氧化氮合酶(iNOS)[14]等在炎性黏膜中表達顯著升高,這些導致黏膜上皮細胞角化和增生、異生加?。唤腔毎ダ?、凋亡的調控受干擾素、APC基因、ras基因信號通路的調控，當APC基因和(或)ras基因發(fā)生突變時APC基因、ras基因信號通路受到影響，這種調控機制可能被打破，從而導致角化的黏膜上皮細胞分泌DK-β增加，這也是結腸癌患者DK-βmRNA相對水平比對照組都要高的原因，在低分化腺癌、Dukes分期B期、有淋巴結轉移的患者中表達更明顯(P<0.05)，同時早期結腸癌患者血清DK-β水平顯著升高[15]，這由于癌細胞對周圍組織浸潤，導致結腸局部黏膜上皮細胞層廣泛受損，并使淋巴結轉移的黏膜上皮細胞層受損，從而引起DK-β表達水平顯著升高[5]，并大量聚集在病變周圍組織，但與患者年齡、性別、腫瘤的位置及大小無關。結腸息肉與潰瘍性結腸炎間DK-βmRNA相對水平無明顯差異，但它們比健康對照組要高(P<0.05)，是由于炎癥局部黏膜上皮細胞層受損導致DK-β表達輕度升高，但升高幅度較結腸癌低得多。

DK-βmRNA在結腸癌早期和進展期表達是顯著升高的，因此組織中DK-β水平檢測對結腸癌的早期診斷和治療有重要意義。

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Level of Dermokine-β mRNA in colon cancer tissue and its clinical significance*

FUHan-dong1,ZHANGAi-hua2,LIUHan-zhong3,YUANAn-long4,WEIWei1
(1.CentralLaboratory;2.DepartmentofGeneralSurgery;3.DepartmentofPathology;4.DepartmentofGastroenterology,XiaoganMunicipalCentralHospital/AffiliatedXiaoganHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofSciencesandTechnology,Xiaogan,Hubei432000,China)

Objective To investigate the level of dermokine-β(DK-β) mRNA in colon cancer tissue and its clinical value.Methods The RT-PCR method was used to detect DK-β mRNA relative level.The DK-β mRNA relative levels were compared among the patients with colon cancer,colonic polyps and ulcerative colitis and normal control group.The DK-β mRNA relative levels were compared among different clinical parameters in colon carcinoma.The statistical awalysis was performed.Results The expression of DK-β mRNA in the patients with colon cancer was significantly higher than that in the patients with colon polyps,ulcerative colitis and normal control group,the difference was statistically significant(P<0.01).But the DK-β mRNA expression had no correlation with age,gender,tumor location and size.The DK-β mRNA expression in the low differentiation adenocarcinoma,Dukes B stage and lymph node metastasis was more significant (P<0.05).Conclusion The DK-β expression in colon cancer is closely associated with mucosal epithelial cell damage.The DK-β expression in the stage B is significantly increased.Therefore,the DK-β level detection in colon tissue may be used as an index of early diagnosis of colon cancer,which has a certain value for early diagnosis of colon cancer.

colon cancer； dermokine-β； mRNA

湖北省自然科學基金項目(2013CFB486)；湖北省孝感市科技局基金支持項目(2011XXF042)。

付漢東，男，在職研究生，醫(yī)學碩士，副主任技師，主要從事腫瘤早期診斷和腫瘤標志物研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.003

A

1672-9455(2015)21-3137-03

2015-01-02

2015-08-31)