廖國(guó)玲，馬 磊，曾 泰

（寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，銀川750004）

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液與組織進(jìn)行物質(zhì)交換的屏障，它通過(guò)合成與釋放大量的血管活性物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)血管的基礎(chǔ)張力，維持血管功能的正常。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)［1］，對(duì)其損傷保護(hù)的研究是目前的熱點(diǎn)。自由基、活性氧、脂質(zhì)過(guò)氧化物、過(guò)氧化氫（H2O2）等均可引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷?？寡趸瘎┳鳛榭山K止自由基產(chǎn)生的一類化學(xué)物質(zhì)，被認(rèn)為在預(yù)防心腦血管疾病及癌癥的發(fā)生中扮演著極其重要的作用［2］。對(duì)中草藥中天然活性成分的研究表明，一些黃酮類化合物具有抗氧化和抗癌作用。張自萍等［3］研究表明：寧夏產(chǎn)的枸杞黃酮化合物中蘆丁和綠原酸含量均高于河北、內(nèi)蒙古枸杞，且有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用［4］。本研究選擇具有調(diào)節(jié)免疫能力、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抑菌、抗氧化等作用的枸杞黃酮化合物作為課題研究的對(duì)象［5－6］，深入研究其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)枸杞黃酮對(duì)H2O2損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）作用的研究，為開(kāi)發(fā)利用枸杞及其有效成分提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥材與試劑 枸杞由寧夏農(nóng)科院提供，陳淑華研究員鑒定，其總黃酮由本研究室分離和純化［7］，含量經(jīng)測(cè)定為100mg/mL；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所；四唑鹽（MTT）試劑為Sigma公司產(chǎn)品；NO試劑盒及NOS試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其余均為國(guó)產(chǎn)試劑（分析純級(jí)）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 儀器CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)Sheldon公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡Olympus產(chǎn)品，酶標(biāo)儀為美國(guó)Me2tertech公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備 采用80%乙醇，60℃超聲提取，減壓濃縮，經(jīng)HPD－600型大孔樹(shù)脂，乙醇洗脫，減壓濃縮后，超純水定容為枸杞黃酮溶液［7－8］。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，鋁鹽法測(cè)定總黃酮的濃度為100mg/mL。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的HUVEC細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，將生長(zhǎng)良好的HUVEC細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化1～2min后，用培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞壁制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組：只加相應(yīng)體積培養(yǎng)液；H2O2損傷模型組（H2O2組）：在培養(yǎng)液中加入1 000μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷4h；枸杞黃酮干預(yù)組：依次分為枸杞黃酮低濃度組、枸杞黃酮中濃度組、枸杞黃酮高濃度組，先分別在培養(yǎng)液中加入終濃度為100、200、400mg/L的枸杞黃酮溶液孵育24h，再加入1 000μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷4h；維生素C（VitC）陽(yáng)性對(duì)照組（VitC組）：在培養(yǎng)液中先加入終濃度為20mg/L的VitC孵育24h，再加入1 000μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷4h。

1.2.4 MTT法檢測(cè)HUVEC活力 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 MTT的光密度（OD）值計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）。IR＝（對(duì)照組OD－實(shí)驗(yàn)組OD）/對(duì)照組OD×100%。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中過(guò)氧化物丙二醛（MDA）、人總一氧化氮合成酶（TNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）和NO的測(cè)定 按實(shí)驗(yàn)分組所述方法處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別按MDA、NOS和NO測(cè)定試劑盒中說(shuō)明書(shū)上所述的方法分別檢測(cè)MDA、TNOS、iNOS和NO的活性，試驗(yàn)重復(fù)3次，每次4個(gè)復(fù)孔，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響H2O2處理HUVEC后其細(xì)胞IR為38.8%，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與H2O2組比較，枸杞黃酮低、中、高濃度組IR顯著降低（P＜0.01），與枸杞黃酮呈劑量依賴性，見(jiàn)表1。

表1 枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響（n＝4）

表2 枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MDA、NOS、iNOS活性及NO含量的影響（±s，n＝4）

表2 枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MDA、NOS、iNOS活性及NO含量的影響（±s，n＝4）

a：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；b：P＜0.01，c：P＜0.05，與H2O2組比較。

組別 NO（μmol/L）TNOS（U/mL）iNOS（U/mL）MDA（nmol/mL）正常對(duì)照組 55.69±8.12b 1.10±0.10b 0.81±0.06b 0.418±0.042b H2O2 組 19.05±6.27a1.78±0.07a1.33±0.06a2.216±0.062a VitC組 39.11±3.09b 1.32±0.06b 0.99±0.06b 1.304±0.105b枸杞黃酮低濃度組 28.15±5.71c 1.59±0.04b 1.16±0.08b 1.796±0.155b枸杞黃酮中濃度組 33.25±3.94b 1.49±0.07b 1.07±0.05b 1.674±0.054b枸杞黃酮高濃度組 37.27±3.72b 1.40±0.07b 1.01±0.06b 1.427±0.106b

2.2 枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力培養(yǎng)上清液中MDA、TNOS、iNOS活性和NO含量的影響與正常對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞內(nèi)MDA含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而枸杞黃酮各濃度組細(xì)胞 MDA生成減少，其變化程度與枸杞黃酮濃度呈正比，與H2O2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。H2O2組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞內(nèi)NO含量降低，TNOS（結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型）活性升高，尤以iNOS活性升高為主，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而枸杞黃酮各濃度組細(xì)胞內(nèi)TNOS、iNOS活性降低，NO生成增多，與H2O2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

3 討 論

造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因素有很多，其中氧化應(yīng)激是造成血管內(nèi)皮損傷較為重要的因素之一，H2O2是體內(nèi)常見(jiàn)的一種活性氧，可促進(jìn)自由基生成，直接作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)，造成脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，致使細(xì)胞膜的損傷［9］。MTT參與活細(xì)胞的能量代謝，直接反映活細(xì)胞的數(shù)量和活性［10］。機(jī)體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)包括酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，NO為內(nèi)皮源性舒血管因子，由NOS催化L－精氨酸和分子氧而合成。內(nèi)皮細(xì)胞有兩種NOS，即iNOS（誘導(dǎo)型）、cNOS（內(nèi)皮型），外源刺激可影響NOS活性或表達(dá)，進(jìn)而影響NO產(chǎn)生與釋放。iNOS在無(wú)病理性刺激時(shí)表達(dá)通常較低或無(wú)表達(dá)，其表達(dá)調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄水平，許多物質(zhì)可上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。cNOS在細(xì)胞中結(jié)構(gòu)性表達(dá)，一些病理性刺激對(duì)其表達(dá)也有調(diào)節(jié)作用［11］。烏蘭格日樂(lè)等［12］研究發(fā)現(xiàn)枸杞黃酮的抗氧化作用與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，羥基化是其抗氧化活性不可缺少的。研究證明黃酮類化合物可顯著降低高脂大鼠血漿氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和MDA水平，提高超氧化物歧化酶（SOD）活力，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功效［13］。賈剛等［14］研究發(fā)現(xiàn)不同種類的枸杞黃酮對(duì)于細(xì)胞的氧化應(yīng)激具有完全不同的作用，而且黃酮對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用與其濃度呈現(xiàn)出很好的相關(guān)性。

本研究采用H2O2誘導(dǎo)HUVEC建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型。研究結(jié)果表明H2O2組內(nèi)皮細(xì)胞的存活率明顯下降，IR為38.8%。加入不同濃度梯度的枸杞黃酮各組其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈下降趨勢(shì)，即枸杞黃酮呈劑量依賴性（P＜0.01）。內(nèi)皮細(xì)胞在H2O2刺激下，與正常對(duì)照組相比，MDA含量明顯增加；加入100、200、400mg/L枸杞黃酮預(yù)先干預(yù)，與H2O2組相比，MDA含量明顯降低（P＜0.01）。而MDA是自由基與生物膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，它的含量反映氧自由基的水平及脂質(zhì)過(guò)氧化程度，因此，MDA含量的降低說(shuō)明枸杞黃酮可通過(guò)抑制過(guò)氧化而減輕H2O2造成的細(xì)胞損傷；同樣，H2O2組NO較正常對(duì)照組比較較低，隨著枸杞黃酮的量增加呈上升趨勢(shì)，損傷后iNOS表達(dá)增強(qiáng)，枸杞黃酮各組iNOS表達(dá)與NO的生成呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。推測(cè)NO升高與cNOS表達(dá)有關(guān)［11］，即枸杞黃酮可能促進(jìn)了血管壁cNOS的表達(dá)，使iNOS的表達(dá)下降，有利于生理性的NO合成并發(fā)揮作用，使其減輕H2O2對(duì)HUVEC的氧化作用，增加NO的生成，其保護(hù)機(jī)制可能為通過(guò)清除自由基，有效提高機(jī)體抗氧化酶的活性來(lái)修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)NOS，催化促進(jìn)NO的合成有關(guān)。與此同時(shí)，本研究也推測(cè)枸杞黃酮在調(diào)節(jié)NO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)的同時(shí)，過(guò)高的NO水平也會(huì)協(xié)同H2O2而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，即枸杞黃酮通過(guò)調(diào)節(jié)NO保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞具有雙面性，而且已經(jīng)有不少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)某些黃酮化合物具有毒性，且其毒性與促氧化作用密不可分［15］。這種誘導(dǎo)細(xì)胞損傷可能與以下機(jī)制有關(guān)：（1）NO作用于鐵蛋白，影響細(xì)胞呼吸及能量代謝；參與過(guò)氧化脂質(zhì)的形成［16］，加速過(guò)氧化亞 硝 基 陰 離 子（ONOO－）等 羥 自 由 基（O H·）等氧化劑的生成；（2）NO及其中間反應(yīng)產(chǎn)物還可激活核修復(fù)多聚酶，抑制DNA合成，間接激活蛋白酶激活受體，引起無(wú)效修復(fù)，最終導(dǎo)致生物能量耗竭，致使細(xì)胞死亡［17］。綜上所述，枸杞黃酮對(duì) H2O2損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO及NOS作用的研究的作用還有待于進(jìn)一步研究。

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