雷學智，徐小龍，胡建敏，孫光曦，李 民，郭 穎，陳 樺，張煥標，趙 明（南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院器官移植科，廣州510282）

慢性腎臟?。–KD）在中國已經成為最為嚴重的公共衛(wèi)生問題之一［1－2］，而腎間質纖維化（RIF）是CKD發(fā)展為終末期腎衰竭的共同路徑。大量研究證明轉化生長因子－β1（TGF－β1）/Smad信號通路在器官纖維化的發(fā)展過程中起著主要作用［3］，且有報告指出TGF－β1/Smad信號通路可能通過調控下游多種microRNA，從而控制上皮間質轉化（EMT）及纖維化［4－6］。目前國內關于miRNA－21在腎臟纖維化機制中的作用報道較少，本實驗通過測定miRNA－21在單側輸尿管梗阻（UUO）大鼠腎臟組織中的表達，初步探討其在TGF－β1/Smad3信號通路中的機制及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇成年SD雄性大鼠20只，體質量200～220g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 RNAlater試劑（美國Sigma公司），RT primers（上海百力格生物技術有限公司），兔抗Smad3單克隆抗體（美國 Milliproe公司），兔抗α平滑肌肌動蛋白（α－SMA）單克隆抗體（美國 Milliproe公司），兔抗TGF－β1抗體（英國Abcam公司），兔抗Ⅰ型膠原蛋白（Col－Ⅰ），多克隆抗體（英國Abcam公司），免疫組織化學試劑盒（美國St.Louis公司），實時定量PCR引物（上海康成生物）。ViiA 7Real－time PCR System（美國 Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、模型建立及標本收集 20只SD大鼠分為UUO組和假手術組（Sham組），以5%異戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉滿意后，腹部皮膚備皮消毒，取左側腹部腎區(qū)切口進入腹腔，UUO組大鼠游離左側輸尿管，并在其上1/3水平處及腎門處以4－0手術線結扎，逐層縫合關閉腹腔。Sham組大鼠只分離但不結扎左側輸尿管。將上述大鼠在建模后第3天、第7天在腹腔麻醉下以0℃生理鹽水灌注血管，并取兩組大鼠左側腎臟，將部分腎臟組織置于10%福爾馬林中固定，部分腎臟置于5倍體積的RNA later試劑中4℃孵育過夜后－20℃保存。

1.2.2 觀察及檢測

1.2.2.1 腎臟組織蘇木素－伊紅（HE）、Masson染色觀察 將固定在10%福爾馬林中的腎臟組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm厚石蠟切片，按常規(guī)方法進行HE、Masson染色。切片HE染色觀察腎小管上皮細胞空泡變性，腎小管萎縮和擴張、間質水腫、纖維化及炎性細胞浸潤等評價腎小管間質損傷情況。Masson染色腎臟纖維化半定量評分［7］：在200倍視野下，隨機選取每張切片5個互不重疊的腎小管間質視野，根據(jù)視野中膠原染色陽性面積占整個視野面積的百分比進行半定量分析，標準為：陽性面積小于2%，0分；陽性面積2%～＜11%為輕度病變，1分；陽性面積11%～＜21%為中度病變，2分；陽性面積21%～30%為重度病變，3分；陽性面積大于30%為極重度病變，4分。

1.2.2.2 腎臟組織免疫組織化學SP染色觀察 大鼠腎組織切片脫蠟和梯度乙醇脫水，在3%H2O2室溫下孵育阻斷內源性H2O2酶，95℃煮沸行抗原修復，胎牛血清工作液封閉，一抗分別加入抗 TGF－β1（1∶100）、抗Smad3（1∶200）、抗α－SMA（1∶200）、抗Col－Ⅰ（1∶200），4℃孵育過夜，再依次加入生物素偶聯(lián)二抗、辣根過氧化酶標記鏈霉素卵白素、DAB顯色、蘇木素復染，最后依次進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在光學顯微鏡200倍視野下觀察，每張切片隨機取5個互不重疊視野拍照。Image－Pro Plus 6.0軟件分析每張照片中陽性染色面積。TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ和α－SMA表達量以陽性面積百分比表示。

1.2.2.3 實時熒光 PCR檢測 microRNA－21的表達 UUO組和Sham組大鼠第3天及第7天腎臟組織RNA抽提按照Trizol試劑說明書進行，并使用紫外吸收對抽提出的RNA進行純度和濃度檢測，測得 A260/A280比值1.8～2.1，變性瓊脂糖凝膠電泳顯示總RNA完整。使用抽提出的腎臟組織RNA進行cDNA合成，配備RT反應液后在PCR擴增儀進行RT反應。實時熒光定量 PCR（Real－time qPCR）檢測組織中microRNA－21，使用 U6作為內參，引物設計 U6，F(xiàn)：5′－GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T－3′，R：5′－CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT－3′；rno－miR－21，GSP：5′－GGG GGG TAG CTT ATC AGA CTG－3′，R：5′－CAG TGC GTG TCG TGG AGT－3′，將 所 有 cDNA 樣 品 分 別 配 置 Real－time qPCR反應體系，5 000r/min短暫離心。將8μL混合液加到384－PCR板對應的每個孔中，再加入對應的2μL cDNA，短暫離心混合，在設置PCR程序前將準備好的PCR板放在冰上，將上述384－PCR板置于Real－time PCR儀上進行PCR反應。U6指標均按以下程序進行：95℃，10min，40個PCR循環(huán)。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按95℃，10 s；60℃，60s；95℃，15s，從60℃緩慢加熱到99℃（儀器自動進行－Ramp Rate為0.05℃/s）。各樣品的目的 miRNA和內參（U6）分別進行 Real－time qPCR 反應，數(shù)據(jù)采用2－△△CT法進行分析，Sham組2－△△CT為1作為基準校正。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析，相關性分析采用Spearman法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠腎臟病理結果 觀察HE染色切片，Sham組腎單位大小形態(tài)未見異常；UUO組建模后3d見腎小管輕度擴張、小管上皮空泡樣變，間質輕度水腫并散在炎癥細胞，建模后7d即可觀察到明顯的腎間質增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等，炎癥細胞浸潤明顯，證明建模成功。在光鏡下觀察Masson染色大鼠腎臟組織，Sham組第3天和第7天腎單位及間質未見異常；UUO組建模后第3天，可見腎小管管腔輕度擴張，部分間質可見少量淡藍色膠原組織沉積，UUO組建模后第7天，腎小管較第3天模型組明顯擴張，間質水腫增寬明顯伴單核細胞及淋巴細胞廣泛浸潤，間質膠原纖維進行性增多、面積擴大、藍染加重（圖1）。UUO組和Sham組3d、7d組織Masson染色膠原陽性面積評分組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F＝194.228，P＜0.01），UUO組3d和7d腎臟組織纖維化程度評分明顯高于同時期Sham組（P＜0.01），UUO組7d纖維化面積與3 d相比顯著增多（P＜0.01），見圖2。

圖1 兩組大鼠腎臟組織病理形態(tài)（Masson×200）

2.2 不同時間點腎臟中microRNA－21的表達 建模后3、7d UUO和Sham組腎組織中miRNA－21表達組間存在差異［（2.33±0.46）vs.（3.50±0.41），F(xiàn)＝61.381，P＜0.01］；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，大鼠腎組織中miRNA－21在UUO組3d和7d的表達量與Sham組（1.00±0.00）比較明顯升高（P＜0.01），7d UUO組腎組織中miRNA－21較3dUUO組明顯升高（P＝0.008）。

圖2 兩組大鼠腎臟Masson染色膠原面積評分

2.3 兩組大鼠腎臟組織不同時間點 TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ、α－SAM免疫組織化學表達 Sham組大鼠3d及7d腎臟組織中TGF－β1僅在腎小管上皮細胞中少量表達，間質中無表達，且各時間點無明顯變化。與Sham組相比，UUO組3d、7d TGF－β1在腎小管上皮細胞和組織間質表達面積隨時間逐漸增多，陽性染色逐漸加深。UUO組和Sham組3d、7d腎臟組織TGF－β1陽性面積組間差異有統(tǒng)計學意義（F＝423.844，P＜0.01），UUO組TGF－β1陽性面積與同時期Sham組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），UUO組7dTGF－β1陽性面積較UUO組3d增多（P＜0.01），見圖3A。

Sham組大鼠3d及7d腎臟組織中Smad3表達無明顯變化，表達于少部分腎小管上皮細胞中。UUO組3d、7dSmad3與Sham組相比，在腎小管上皮細胞、組織間質表達面積明顯增多，且強陽性表達于UUO組7d組織。UUO組和Sham組各時間點腎臟組織Smad3陽性面積組間差異有統(tǒng)計學意義（F＝768.544，P＜0.01），UUO組Smad3陽性面積明顯多于同時期Sham組（P＜0.01），UUO組7dSmad3陽性面積多于UUO組3d（P＜0.01），見圖3B。

Sham組Col－Ⅰ在腎小管間質少量表達，與同時間Sham組比較，UUO組大鼠腎臟組織Col－Ⅰ蛋白表達面積明顯增多，建模后時間越長，陽性面積表達越多（圖4）。組間Col－Ⅰ表達面積差異有統(tǒng)計學意義（F＝1108.079，P＜0.01），各組間兩兩比較，UUO組Col－Ⅰ陽性面積多于同時期Sham組（P＜0.01），UUO組7dCol－Ⅰ陽性面積多于 UUO 組3d（P＜0.01）（圖3C）。α－SMA在Sham 組陽性面積較少，UUO組α－SMA在腎組織間質中表達面積隨建模后時間延長增多，7d陽性染色最深（圖4）。組間α－SMA表達面積具有明顯差異有統(tǒng)計學意義（F＝292.363，P＜0.01），各組間兩兩比較，UUO組α－SMA陽性面積多于同時期Sham組（P＜0.01），UUO組7d α－SMA陽性面積明顯較UUO組3d增多（P＜0.01）（圖3D）。

圖3 兩組大鼠腎組織 TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ和α－SMA蛋白陽性面積比較

圖4 兩組大鼠腎組織不同時間點Col－Ⅰ和α－SMA蛋白表達比較（免疫組織化學染色×200）

2.4 相關性分析 TGF－β1、Smad3與腎組織中 miRNA－21呈正相關（r＝0.799、0.849，P＜0.01），腎組織 miRNA－21與腎組織 纖 維 化 程 度、Col－Ⅰ 和 α－SMA 呈 正 相 關（r＝0.888、0.882、0.896，P＜0.01）。

3 討 論

纖維化是以細胞外基質（ECM）過度積聚、成纖維細胞增生，以及腎單位萎縮消失等為病理特點［4］，是腎、心、肺、肝等器官發(fā)生漸進性疾病，最終發(fā)展為終末期器官衰竭的共同通路，但是對于腎臟纖維化發(fā)生的分子機制認識尚不完全明確［8］。MicroRNAs是一類廣泛存在于動植物基因組中的功能性非編碼小分子RNA，主要功能是通過與靶基因mRNA特定位點結合，在轉錄水平參與基因的表達和調控，近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA參與幾乎每個細胞的生理及病理發(fā)生過程，而且miRNAs的異常調節(jié)與包括CKD在內的眾多人類疾病密切相關。

UUO大鼠是腎臟炎癥及RIF公認經典模型，HE染色顯示隨著UUO建模時間延長，腎間質損害逐漸加重，Masson染色也觀察到實驗組術后間質纖維化程度加重，證明大鼠腎臟間質纖維化模型建模成功。TGF－β1/Smad3是纖維化發(fā)生機制中重要的信號通路之一［3］，TGF－β1通過下游受體激活型介質Smad3、Smad2正向調控致纖維化基因表達從而介導EMT［9］，另一方面，大部分RIF來源于損傷腎組織通過Ⅱ型EMT而來的腎小管上皮細胞，通過EMT機制，腎小管上皮細胞失去頂點－基底極性，形態(tài)變細長，破壞基底膜從而侵入腎小管間隙，并表達α－SMA等間皮細胞標志，產生以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的ECM［10］。在本實驗中，3dUUO組腎組織纖維化評分較低，腎臟組織中 TGF－β1、Smad3蛋白少量表達，且α－SMA 和 Col－Ⅰ亦有陽性表達，說明是腎臟纖維化和EMT的初期階段，但是7dUUO組腎臟組織masson染色纖維化評分較3d組明顯升高，腎組織中 TGF－β1、Smad3、α－SMA、Col－Ⅰ陽性面積較3dUUO組顯著增多、染色加深，可見隨著建模后時間延長，TGF－β1/Smad3信號通路被激活，組織纖維化和EMT程度伴隨TGF－β1、Smad3表達增強進行性加重。

在腎實質細胞，很多miRNAs接受TGF－β1的調控，例如miRNA－21、miRNA29家族、miRNA93、miRNA377、miR－216a、miRNA200家族［11］，在RIF發(fā)展過程中，上述miRNAs表達是通過 TGF－β1/Smad3這一信號通路實現(xiàn)［12－13］，而不是依賴Smad2［12］，保守的 Smad3結合在 miRNA－21、miRNA29、miRNA－192啟動子區(qū)域位點，所以miRNAs可能是TGF－β1/Smad3信號通路調控腎臟纖維化的重要下游介質［4］。本次實驗發(fā)現(xiàn)，UUO組大鼠腎臟組織中miRNA－21在建模后3d、7d呈增加趨勢，并與TGF－β1/Smad3蛋白、腎組織纖維化評分、α－SMA、Col－Ⅰ呈正相關，所以 TGF－β1/Smad3可能通過上調miRNA－21從而誘導EMT導致RIF。

綜上所述，UUO大鼠腎組織中miRNA－21隨纖維化程度加重表達上調，TGF－β1/Smad3信號通路可能通過正向調控miRNA－21從而誘導RIF。隨著檢測技術及對miRNA進一步研究，miRNA有望成為預測及診斷CKD新型標志物。

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