湯 慧，李 峰，程曉峰，陳艷秋，白 雯，湯迎爽，李世梅

(1. 解放軍第323醫(yī)院，陜西 西安 710056；2. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

補腎祛斑顆粒治療黃褐斑的血清藥理學研究

湯 慧1，李 峰2，程曉峰1，陳艷秋1，白 雯1，湯迎爽1，李世梅1

(1. 解放軍第323醫(yī)院，陜西 西安 710056；2. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

目的 通過體外實驗闡述補腎祛斑顆粒治療黃褐斑的血清藥理學作用機制。方法 按臨床用量的24，12，6倍作為本實驗的高、中、低劑量組對大鼠灌胃并提取含藥血清，對照組灌入生理鹽水。A375和B16細胞作為本實驗的研究對象，含藥血清處理24h、48h和72h后檢測細胞活性、黑色素含量及酪氨酸酶活性。結果 補腎祛斑顆粒含藥血清能明顯促進A375和B16細胞增殖且呈濃度依賴和時間依賴效應。其能顯著抑制細胞內黑色素含量及酪氨酸酶活性。結論 補腎祛斑顆粒通過抑制細胞內酪氨酸酶的活性抑制細胞內黑色素的合成，從而起到治療黃褐斑的藥效。

黃褐斑；補腎祛斑顆粒；含藥血清；細胞活性；黑色素；酶氨酸酶活性

黃褐斑是臨床常見的顏面皮膚色素沉著性損容性疾病，多見于女性，其臨床表現(xiàn)以面部呈對稱蝴蝶狀,或局限性褐色或淡褐色斑片為特點。雖無不適癥狀，但嚴重影響患者的身心健康。前期臨床對辨證為腎虛血瘀型黃褐斑患者采用補腎祛斑顆粒治療，收到良好療效，且無不良反應[1]。現(xiàn)對補腎祛斑顆粒進行血清藥理學體外實驗，以探討其消斑作用機制。

1 實驗資料

1.1材料

1.1.1實驗藥物 補腎祛斑顆粒：解放軍第323醫(yī)院藥廠生產(chǎn)，科研用藥。

1.1.2實驗動物 SPF級成年雌性SD大鼠20只，購買并飼養(yǎng)于西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK2007-001。

1.1.3實驗細胞 A375人黑素瘤細胞、B16小鼠黑色素瘤細胞，均為西安交通大學醫(yī)學院中心實驗室饋贈。

1.1.4主要試劑 胰蛋白酶、MTT、酪氨酸、酪氨酸酶、左旋多巴購自Sigma公司，無酚紅DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素母液，購自Gibico公司；三氯乙酸、乙醇、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、二甲基亞砜(DMSO)、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水合氯醛，購于西安交通大學試劑科。

1.1.5主要儀器 NAPCO-5410型CO2培養(yǎng)箱、OLYMPUS倒置顯微鏡、Bio-Teck多功能酶標儀、水浴鍋、高壓滅菌鍋、冰箱、超凈臺、Millipore一次性濾器、電熱恒溫干燥箱、普通離心機、水平離心機、培養(yǎng)皿、96孔板、48孔板、6孔板、離心管、吸管、加樣槍及其槍頭、微量振蕩器，由西安交通大學醫(yī)學院中心實驗室提供。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將A375和B16分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中。待細胞狀態(tài)良好，呈對數(shù)生長時，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，PBS中和后離心，按實驗要求種板。培養(yǎng)基中均含有青霉素和鏈霉素。

1.2.2含藥血清的制備 補腎祛斑顆粒以臨床單次用量的24,12,6倍作為本實驗的高、中、低劑量。將大鼠分為生理鹽水組、補腎祛斑高劑量組、補腎祛斑中劑量組、補腎祛斑低劑量組，每組5只，分別灌胃生理鹽水及相應劑量補腎祛斑顆粒，2次/d，共3 d。末次給藥前8 h禁食不禁水。末次給藥1 h后腹腔注射1%水合氯醛麻醉，下腔靜脈采血并分裝于離心管中。水平離心機3 000 r/min離心20 min，吸取上層血清于無菌離心管中，再次離心。取上清于離心管中，經(jīng)56 ℃恒溫水浴30 min處理滅活補體后分裝，置-20 ℃凍存?zhèn)溆肹2]。所有操作盡可能做到無菌。

1.2.3細胞增殖情況測定 采用MTT法測定。細胞懸于無血清培養(yǎng)基，按4 500個/孔種于96孔板，每孔100 μL，每組6個副孔。過夜后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含10%不同血清組血清的培養(yǎng)基。達到處理時間后，每孔加入MTT母液20 μL，混勻后放回細胞培養(yǎng)箱。4 h后棄上清液，加入DMSO 150 μL/孔，振蕩5 min左右，置于酶標儀，波長490 nm測定OD值。

1.2.4酪氨酸酶活性測定 取各血清組血清100 μL于48孔板中，每組設6個副孔。加pH 6.8磷酸鹽緩沖液56 μL與2.0 mmol/L的酪氨酸溶液94 μL,混合均勻后在冰水浴中迅速加入50 μmol/L的酪氨酸酶溶液50 μL，混勻，37 ℃孵育10 min，于490 nm處測定各孔OD值。

1.2.5細胞酪氨酸酶活性測定 采用多巴色素法測定。細胞懸于無血清培養(yǎng)基，按15萬個/孔種于6孔板，每孔1 mL。過夜后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入含10%不同血清組血清的培養(yǎng)基2 mL。達到處理時間后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，胰酶消化后離心，PBS重懸、計數(shù)，按每孔2萬個細胞種于96孔板，每孔50 μL，每組設6個副孔。每孔加2% TritonX-100溶液50 μL，混勻后迅速置-80 ℃凍存30 min，隨后室溫融化使細胞完全破裂，37 ℃預溫后加入1%左旋多巴溶液20 μL，37 ℃反應2 h，測定490 nm處的OD值，即代表酪氨酸酶活性[3]。

1.2.6細胞內黑色素含量測定 采用NaOH小時溶解法測定。細胞處理同上,取12萬個細胞于EP管中,超聲破碎,離心,沉淀用10%三氯乙酸和乙醇洗滌,1 200 r/min離心5 min，傾上清液，加入1 mL含10%DMSO的1 mmol/L NaOH溶液，80 ℃水浴2 h后按每孔150 μL種于96孔板，490 nm測OD值，即代表黑色素含量[3]。

1.3統(tǒng)計學方法 使用Graphpad prism 5及photosho7.0對實驗數(shù)據(jù)進行整理并做圖。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。P<0.0為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組A375和B16增殖情況比較 在24 h時，含藥血清對細胞增殖的影響不明顯，僅A375在高劑量組相對于對照組增殖加快，且差異有統(tǒng)計學意義。隨著處理時間的延長，相比于對照組，含藥血清促增殖效應突出，并存在顯著的時間梯度依賴和濃度梯度依賴效應。另外，相對于B16，A375對含藥血清更為敏感。說明補腎祛斑顆粒在使用過程中并不是通過影響細胞活性來起到祛斑的效果。見圖1及圖2。

2.2各組A375和B16內黑色素含量比較 在處理24h時，含藥血清對A375和B16細胞內黑色素含量的影響并不明顯。隨著處理時間的延長，含藥血清對黑色素含量的降低效應越來越突出，呈現(xiàn)明顯的時間梯度依賴和濃度梯度依賴效應(P<0.05)。由此可以發(fā)現(xiàn)，補腎祛斑顆粒的確切療效主要是其能夠降低細胞內黑色素的含量。見圖3及圖4。

圖1 各組A375細胞增殖情況

圖2 各組B16細胞增殖情況

圖3 各組A375細胞內黑色素含量

圖4 各組B16細胞內黑色素含量

2.3各組酪氨酸酶自身活性比較 各組酪氨酸酶活性比較差異均無統(tǒng)計學意義。見圖5。

2.4各組A375和B16內酪氨酸酶活性比較 在處理24 h時，含藥血清對A375和B16細胞內酪氨酸酶活性的影響并不明顯，僅高劑量組含藥血清能部分抑制其活性。隨著處理

圖5 各組酪氨酸酶自身活性比較時間的延長，含藥血清對酪氨酸酶活性的抑制效應越來越突出，且呈現(xiàn)明顯的時間梯度依賴和濃度梯度依賴效應。見圖6和圖7。

圖6 各組A375細胞內酪氨酸酶活性

圖7 各組B16細胞內酪氨酸酶活性

3 討 論

黃褐斑屬于祖國醫(yī)學“黧黑斑”范疇，黃褐斑的發(fā)生與肝脾腎功能失調、氣血瘀滯、面容失于濡養(yǎng)關系密切，臨床上根據(jù)不同證型采取相應治療。補腎祛斑顆粒是解放軍第323醫(yī)院科研制劑，由枸杞子、菟絲子、覆盆子、補骨脂、當歸、白

芍、川芎、蒲黃、土鱉蟲組成。其中枸杞子、菟絲子補腎氣，益精血，補而不膩為君藥；當歸、白芍、川芎補血活血，補而不滯為臣藥；佐以覆盆子、補骨脂、蒲黃、土鱉蟲固腎，祛瘀，行血消斑。諸藥合用，共奏補腎益精、養(yǎng)血活血、化瘀祛斑之功效，適用于腎虛血瘀型黃褐斑。

補腎祛斑顆粒在臨床使用中效果明顯，對辨證準確、藥證相合的黃褐斑患者，起效快者可在用藥3 d即可見黃褐斑的面積及程度均有減少。在體外研究中，補腎祛斑顆粒通過大鼠代謝，其有效成分會貯存于血清之中，本實驗方法提取的血清中藥物有效成分濃度高、效價高[4]。細胞實驗表明補腎祛斑顆粒并不是通過抑制細胞活性而發(fā)揮藥效，其能促進黑色素細胞的增殖，促進黃褐斑患者黑色素細胞的新陳代謝與局部修復，與藥物的補腎養(yǎng)血活血效應相符合。含藥血清處理后，細胞中黑色素的含量明顯降低，且隨著作用時間的延長以及藥物濃度的增加，效應愈加明顯。細胞內酪氨酸酶活性的強弱直接與黑色素的量呈正相關[5]，其在黑色素的合成中起到至關重要的作用。含藥血清本身并不能影響酪氨酸酶的活性，但通過細胞代謝后，其能顯著抑制酪氨酸酶的活性，從而抑制細胞內黑色素的合成。提示補腎祛斑顆粒能明顯抑制黑色素細胞內黑色素的合成，其抑制細胞內酪氨酸酶活性是潛在的重要途徑。補腎祛斑顆粒具體是如何抑制酪氨酸的活性，是否同時促進了黑色素的代謝從而使細胞內黑色素含量降低以及其分子機制還有待后續(xù)研究。

[1] 李世梅,程小紅,房武寧,等. 補腎祛斑顆粒治療黃褐斑98例療效觀察[J]. 新中醫(yī),2008,40(7):21-22

[2] 李世梅. 宮瘤清含藥血清對子宮肌瘤作用機理的實驗研究[D]. 成都：成都中醫(yī)藥大學,2002

[3] 鄭錦芬. 白藜蘆醇對培養(yǎng)的人黑素細胞的影響[D]. 汕頭：汕頭大學,2009

[4] 張軍平,張伯禮,山本清高，等. 中藥藥物血清的制作方法探討[J]. 天津中醫(yī)藥,2004,21(4):274-276

[5] 向亞萍. 腎著祛斑顆粒劑對黃褐斑及黑素影響的研究[D]. 長沙：湖南中醫(yī)學院,2003

Study on the serum pharmacology of Bushen Quban granule in the treatment of chloasma

TANG Hui1, LI Feng2, CHENG Xiaofeng1, CHEN Yanqiu1, BAI Wen1, TANG Yingshuang1, LI Shimei1

(1.The 323th Hospital of PLA, Xi’an 710056, Shaanxi, China; 2.The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi, China)

Objective It is to explore the mechanism of serum pharmacology of Bushen Quban granule in the treatment of chloasma through experiments in vitro. Methods Bushen Quban granule was administrated to rats at the doses which were 24，12 and 6 folds higher than that used in the clinic while normal saline was used as the control. After three days treatment, drug serum was extracted. A375 and B16 were treated with drug serum for 24 h, 48 h and 72 h and then cells viability, the content of melanin and the activity of tyrosinase were assessed. Results Drug serum could promote cells viability in dose and time dependent manner,it could significantly reduce the content of melanin within cells and inhibit tyrosinase activity. Conclusion Bushen Quban granule inhibits tyrosinase activity to reduce the synthesis of melanin to cure chloasma

chloasma; Bushen Quban granule; drug serum; cells viability; melanin; tyrosinase’s activity

湯慧，女，碩士，醫(yī)師，研究方向為中醫(yī)臨床。

李世梅，E-mail：262420592@qq.com

蘭州軍區(qū)基金資助課題(CLZ12JB32)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.08.002

R-332

A

1008-8849(2015)08-0802-03

2014-09-30