王 婷 蔣覺安 胡筱涵 潘建中 武 劍 劉翠平 張學光

(蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，蘇州 215123)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎、關節(jié)軟骨和骨進行性破壞為特征的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、進行性關節(jié)炎。其病因尚未完全揭示，文獻報道CD4+T 細胞、B 細胞異常活化與其發(fā)生發(fā)展密切相關。

T 細胞活化需要雙信號，T 細胞受體(T cell receptor，TCR)與抗原提呈細胞(Antigen-presenting cells，APC)表面的抗原肽-MHC 分子結合提供第一信號，T 細胞與APC 表面的共刺激分子結合提供第二信號。其中，ICOS/ICOSL 是一對重要的正性共刺激分子，屬于B7/CD28 家族。ICOS 分子誘導表達于活化的T 細胞及記憶性T 細胞表面，ICOSL 主要表達于外周成熟的B 細胞、樹突細胞、巨噬細胞等［1］。既往研究表明，ICOS/ICOSL 與自身免疫病、感染性疾病及腫瘤免疫的發(fā)生發(fā)展密切相關［2-4］。在T 細胞的活化過程中可誘導共刺激分子(ICOS)和其配體(ICOSL)結合，在免疫效應階段發(fā)揮作用，可促進活化T 細胞合成分泌IL-2、IL-4 和IFN-γ，輔助T 細胞依賴性B 細胞的活化［5］，在類風濕性關節(jié)炎的免疫紊亂和免疫損傷中扮演重要角色。

本文采用免疫熒光標記流式細胞術和RT-PCR檢測RA 患者外周血淋巴細胞亞群ICOS/ICOSL 分子的異常表達，結合RA 患者臨床特點探討與疾病活動度、臨床治療之間的相關性，揭示其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 2012 年6 月～2013 年1 月在蘇州大學附屬第一醫(yī)院、蘇州大學附屬第三醫(yī)院風濕免疫科就診的門診和住院的RA 患者，共計85 例，以及跟蹤調查的復診者共計15 例。所有病例均符合1987 年美國風濕病學會修訂的RA 診斷標準［6］，均未經(jīng)激素或免疫抑制劑治療并排除其他自身免疫性疾病。其中男性24 例，女性61 例，平均年齡(50.06±13.99)歲。根據(jù)美國風濕病學協(xié)會RA緩解標準［7］分為急性活動期患者47 名，慢性緩解期患者38 名。對其中的15 例接受臨床治療的RA 患者進行動態(tài)檢測ICOS 和ICOSL 的變化，同時選取來自蘇州大學附屬第一醫(yī)院的50 例健康志愿者作為正常對照組(Healthy control，HC)，均無過敏性疾病、自身免疫性疾病，近期無感染性疾病。其中男性18 例，女性32 例，平均年齡(52.62±12.34)歲。其性別、年齡構成與RA 組均無統(tǒng)計學差異。RA 患者和HC 同期收取標本。

1.2 試劑和儀器 TRIZOL 和RT-PCR 兩步法逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa 公司);DEPC(北京索萊寶科技有限公司);人淋巴細胞分離液(挪威Axisshield 公司);FITC 標記的小鼠抗人CD4、CD19、CD14 單克隆抗體(美國Beckman-Coulter 公司);PE標記的小鼠抗人ICOS、ICOSL 單克隆抗體(美國Biolegend 公司);FITC 和PE 標記的小鼠IgG 作為同型對照(美國Beckman-Coulter 公司);紅細胞裂解液(美國Beckman-Coulter 公司);離心機(德國Eppendorf 公司);流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司);RT-PCR 儀(美國Bio-rad 公司)。

1.3 方法及步驟

1.3.1 標本的采集 清晨采集受試者外周靜脈血5 ml，肝素抗凝，取2 ml 進行流式細胞術檢測外周血CD4+T 細胞表面ICOS 的表達及CD14+單核細胞和CD19+B 細胞表面ICOSL 的表達，剩余3 ml 用于后續(xù)檢測ICOS/ICOSL mRNA 水平表達。

1.3.2 ICOS/ICOSL mRNA 水平檢測 根據(jù)Primer Premier 6.0 軟件自行設計ICOS、ICOSL、β-actin 引物序列，引物序列分別為:ICOS 上游5'-GCCCTCTGGTATTTCTTTCTCTTCTG-3'，下 游 5'-TAGGGTCACATCTGTGAGTCTA-3';ICOSL:上游5'-ATGCGGCTGGGCAGTCCTGGACTG-3'，下 游5'-GCTCTGTCTCCGGACTCACAG-3';β-actin 上 游5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACA-3'，下游5'-GATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'。RNA 采用TRIZOL 試劑提取，按照RNA 提取步驟提取各組樣本RNA 并測定濃度和純度。以其為模板按照反轉錄試劑盒說明書逆轉錄cDNA，然后取5 μl cDNA 作為模板，PCR 條件為94℃預變性2 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，進行半定量分析。RT-PCR 總反應體系為15 μl，含1 μl 模板cDNA，上下引物各0.25 μl，7.5 μl SYBR Green 混合液和6 μl 水。程序為95℃2 min 預變性;PCR 兩步法，95℃變性10 s，60℃退火30 s，45 個循環(huán)，β-actin 作為內參，結果以cycle threshold (CT，單個PCR 反應達到對數(shù)擴增期的循環(huán)數(shù))表示。將目的基因的CT值減去β-actin 的CT 值得到ΔCT，基因的表達量由2-ΔCT表示。

1.3.3 流式細胞術檢測外周血PBMC 表面ICOS和ICOSL 的表達 采集肝素抗凝的RA 患者和HC外周血2 ml/人，全血50 μl/test，按照說明書的要求分別加入適當體積的CD4-FITC、CD14-FITC、CD19-FITC、ICOS-PE 和ICOSL-PE 直標抗體，同時設IgG同型對照管，室溫避光反應20～30 min。每管加入紅細胞裂解液250 μl，充分震蕩置于40℃水浴3 min 后加2 ml PBS 終止紅細胞裂解反應，1 600 r/min 5 min 離心后棄上清。加0.5 ml PBS/test 成細胞懸液，上流式細胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計學分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用t 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RA 患者外周血PBMCs 中ICOS/ICOSL mRNA上調表達 通過RT-PCR 的方法檢測類風濕性關節(jié)炎患者和健康對照PBMC 中ICOS 和ICOSL 的mRNA的表達水平。結果顯示，RA 患者PBMC 中ICOS 和ICOSL mRNA 的表達均高于健康對照(圖1)。

圖1 各組樣本ICOS 和ICOSL 基因擴增產(chǎn)物電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of gene ICOS and ICOSL amplification product on every groups

2.2 RA 患者外周血CD4+T 細胞表面ICOS 的表達以及B 細胞、單核細胞表面ICOSL 的表達 通過免疫熒光標記流式細胞術檢測外周血PBMC 表面ICOS 和ICOSL 的表達。結果顯示，RA 患者外周血CD4+T 細胞表面ICOS 分子表達顯著高于HC［(7.08±4.72)% vs (3.01±1.39)%，P＜0.000 1］具有統(tǒng)計學差異;CD14+單核細胞和CD19+B淋巴細胞上ICOSL 表達均顯著高于HC［(5.77±3.45)%vs (3.64± 1.43)%，P ＜0.05;(5.78± 4.52)%vs(3.97±1.63)%，P＜0.05］均具有統(tǒng)計學差異(圖2)。

圖2 流式細胞術檢測各組樣本ICOS 和ICOSL 蛋白水平表達Fig.2 Expression of ICOS and ICOSL in every groups were detected at protein levels respectively by flow cytometry

圖3 急性活動期和慢性緩解期患者PBMC 上ICOS 和ICOSL 的表達Fig.3 Expression of ICOS and ICOSL PBMC both in active RA patients and inactive RA patients

圖4 同一患者治療前后外周血淋巴細胞亞群表面ICOS/ICOSL 的表達Fig.4 Expression of ICOS and ICOSL in PBMCs of these patients before and after therapy

表1 類風濕性關節(jié)炎患者ICOS/ICOSL 的表達水平與各臨床特征的相關性Tab.1 Correlation between ICOS/ICOSL in PBMCs and clinical characteristics of RA patients

2.3 RA 患者外周血ICOS 和ICOSL 的表達與臨床特點的相關性 將85 例RA 患者按照美國風濕病學會修訂的RA 分類標準分為急性活動期(n=47)及慢性緩解期(n=38)。結果顯示，初發(fā)RA 病患者中急性活動期組CD4+T 細胞ICOS 的表達較慢性緩解期組無明顯變化［(7.10±4.74)% vs (6.37±4.88)%，P=0.530］(圖3A)。初發(fā)RA 病患者中急性活動期組CD14+單核細胞、CD19+B 細胞上ICOSL的表達較慢性緩解期組呈上調表達［(5.45±3.50)% vs (4.04±1.55%)，P=0.036］、［(6.59±5.74)% vs (5.63±4.30%)，P=0.016］，有統(tǒng)計學意義(圖3B、C)。對15 例接受治療的RA 患者動態(tài)檢測ICOS 和ICOSL 的表達。結果顯示，與治療前相比，治療后CD4+T 細胞表面ICOS 的表達明顯降低［(3.74±0.57)% vs (8.62±1.77)%，P=0.011］有統(tǒng)計學意義(圖4A)。此外，ICOSL 在CD14+單核細胞表面的表達有下降趨勢，但無顯著差異［(3.33±0.31)% vs (5.56±1.11)%，P=0.076］(圖4 B);ICOSL 在CD19+B 淋巴細胞表面的表達也低于治療前水平［(5.12±1.23)% vs (9.99±2.02)%，P=0.045］(圖4C)。進一步用統(tǒng)計學方法對RA 患者PBMC 上ICOS/ICOSL 的表達與RA各項實驗室指標之間進行相關性分析，結果提示，ICOS 和ICOSL 的表達與患者年齡、抗O、RF、抗CCP、ESR、CRP 均未見顯著相關性(表1)。

3 討論

RA 是一種常見的自身免疫性疾病，在RA 的發(fā)生、發(fā)展過程中，由于T、B 細胞的過度活化使得自身抗體大量合成最終導致全身多個部位發(fā)生慢性炎癥。最近研究表明，濾泡輔助性T 細胞(T follicuhr cells，Tfh)細胞對于B 細胞生發(fā)中心的形成和抗體的產(chǎn)生及類型轉換起著重要作用［8］，而既往研究表明，ICOS/ICOSL 與Tfh 的分化、發(fā)育、轉運和定位密切相關，ICOS 主要表達于T 細胞活化后的Tfh，在T細胞依賴的抗體反應中起著重要作用，而ICOSL 主要表達于B 細胞上，與Tfh 上的ICOS 相互作用誘導Tfh 產(chǎn)生IL-21 以及促進B 細胞體液免疫應答的細胞因子如IL-4、IL-5 和IL-10 等［9-11］。Akiba 等［12］研究顯示人和小鼠缺乏ICOS 時可以導致Tfh 大量減少，并且出現(xiàn)B 細胞成熟以及免疫球蛋白同型轉換的障礙。由于Tfh 的多種生物學特征，其功能的缺陷或亢進都可能會導致免疫的紊亂，Tfh 及其相關分子的功能缺陷會導致B 細胞的抗體反應不能正常進行;而Tfh 及其相關分子的功能亢進會導致自身免疫性疾病的發(fā)生。上述研究表明ICOS/ICOSL信號通過調節(jié)Tfh 細胞的增殖分化而對B 細胞免疫應答產(chǎn)生影響。已報道ICOS/ICOSL 參與了多種自身免疫性疾病的病理過程。在甲狀腺機能亢進(GD)、系統(tǒng)性硬化癥(SS)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等自身性免疫疾病中，ICOS 和ICOSL 均呈上調表達［13-15］，這表明ICOS/ICOSL 信號通路與自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

為進一步研究ICOS/ICOSL 在類風濕性關節(jié)炎中的異常表達，本研究通過流式細胞術以及Real-Time 的方法檢測了ICOS/ICOSL 在患者外周血單個核細胞上的表達。結果顯示，與HC 相比，RA 患者CD4+T 細胞上ICOS 和單核細胞以及B 細胞表面ICOSL 的蛋白和mRNA 水平表達都顯著增高。推測可能機制是作為一種抗原提呈細胞，單核細胞上的ICOSL 過度表達與CD4+T 細胞上的ICOS 相互作用，加強了ICOS/ICOSL 信號，促進了T 細胞的進一步活化、增殖，并介導其長期存活，而既往研究表明ICOS/ICOSL 信號誘導活化T 淋巴細胞從而可能參與RA 的免疫紊亂和免疫損傷［16］。此外，B 細胞表面的ICOSL 也異常升高，提示在RA 患者體內存在CD4+T 細胞與B 細胞之間的ICOS/ICOSL 信號增強，其上調的共刺激信號可能啟動Tfh 細胞反應，對B 細胞產(chǎn)生過強的輔助信號，使B 細胞過度活化分泌誘導病理損傷的自身抗體，而相關研究證實，在RA 患者PBMC 中CD4+CXCR5+ICOShighTfh 細胞顯著增加，Tfh 相關的細胞因子IL-21 的含量也顯著增加［17］。因此在RA 患者體內，其增強的ICOS/ICOSL 共刺激信號可能同時介導了自身反應性的細胞與體液免疫，從而參與了RA 的起病。

Hamel 等［18］研究發(fā)現(xiàn)B 細胞上表達的ICOSL對生發(fā)中心的形成和維持以及對Tfh 細胞數(shù)量和抗體的產(chǎn)生必不可少，ICOS 和ICOSL 信號調控炎癥因子的產(chǎn)生在蛋白聚糖誘導的關節(jié)炎中有重要作用。本研究顯示，活動期患者單核細胞和B 細胞上ICOSL 的表達明顯高于緩解期患者，提示ICOSL 可能對RA 患者的急性發(fā)病和慢性緩解起著重要作用?；顒悠诨颊逫COSL 的過度表達進一步促進Tfh細胞效應，產(chǎn)生更多的自身抗體，臨床出現(xiàn)更為嚴重的癥狀。近期國內學者研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者外周血Tfh 表達率高于健康對照，并且治療后RA 患者的Tfh 表達率有所下降，提示Tfh 的過度表達可能參與了RA 的疾病進展［19］，本研究顯示，對同一患者在接受激素治療后，CD4+T 細胞上ICOS 和單核細胞以及B 細胞上ICOSL 的表達均有所下降，可能導致共刺激信號減弱，降低了其體內Tfh 細胞效應，減少了B 細胞的活化程度，從而抑制自身免疫反應，臨床表現(xiàn)為疾病緩解。已有研究顯示，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中IL-21 水平異常增高，而在阻斷ICOS/ICOSL 相互作用或者中和IL-21 后均可以降低生發(fā)中心和自身性抗體的形成［20，21］。

綜上所述，初發(fā)的RA 患者CD4+T 細胞上ICOS以及單核細胞和B 細胞上的ICOSL 異常上調表達，且與疾病嚴重性和臨床治療密切相關，提示我們，ICOS/ICOSL 共刺激信號的異?？赡苁荝A 發(fā)病機制的誘導原因，而對于ICOS/ICOSL 信號通路的具體調控作用以及在RA 免疫病理中的具體機制尚需進一步研究。

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