鄒金海 孔祥軍 李春英 孫鑫義 劉晨第 (河北省滄州市中心醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，滄州 061001)

肝硬化住院患者中有25%到47%會發(fā)生細菌感染，感染的發(fā)生會進一步觸發(fā)全身性炎癥和器官衰竭，其死亡率是不發(fā)生細菌感染患者的4 倍，感染如向多器官衰竭和敗血癥休克進展，則肝硬化患者的死亡率將超過75%［1］。而自發(fā)性細菌性腹膜炎(Spontaneous bacterial peritonitis，SBP)是肝硬化失代償期患者比較常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，SBP 會加重肝硬化患者肝功能的失代償程度，預(yù)后差。肝硬化患者發(fā)生SBP 的處置難點在于感染的診斷，受感染者腹水培養(yǎng)陽性率在50%～70%，在肝硬化失代償期，常規(guī)的臨床參數(shù)不能對感染做出鑒別診斷，經(jīng)常延誤細菌感染的診斷和治療［2-4］。然而在臨床上通常在未得到感染的證據(jù)之前就已開始應(yīng)用廣譜抗生素進行治療，且隨著臨床癥狀進展，抗生素也在不斷升級，因此必須找到能夠幫助臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確地做出處置決定的診斷肝硬化并自發(fā)性細菌性腹膜炎的新工具。本文回顧分析了165 例肝硬化腹水患者中性粒細胞表面CD64、CD32 指數(shù)(nCD64 ID、nCD32 ID)與細菌感染的關(guān)系，并與血清CRP 等炎性指標(biāo)進行比較，探討其在肝硬化并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎早期診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2013 年9 月至2013 年12 月收治失代償期肝硬化腹水的患者，分為SBP 組和腹水非SBP 組，入選病例數(shù)共156 例，其中SBP組103 例，患者急診入院，病史時間≤48 h，乙型肝炎肝硬化患者86 例，丙型肝炎肝硬化患者17 例;非SBP 組53 例，乙型肝炎肝硬化患者44 例，丙型肝炎肝硬化患者9 例。

1.2 肝硬化及SBP 診斷依據(jù) 肝硬化的診斷符合2000 年西安全國第十次病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議方案的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。SBP 的診斷依據(jù)為:(1)有腹痛、發(fā)熱、腹部壓痛及反跳痛等;(2)腹水常規(guī)檢查白細胞＞0.3 ×109L-1，中性粒細胞比值＞0.25 L-1，腹水細菌培養(yǎng)陽性;(3)腹水常規(guī)檢查白細胞＞0.3 ×109L，中性粒細胞比值＞0.25，結(jié)合臨床可診斷自發(fā)性腹膜炎;(4)排除結(jié)核性、繼發(fā)性腹膜炎或腫瘤性腹水。符合(2)(4)或(1)(3)(4)可做出診斷［6］。

1.3 標(biāo)本采集 患者急診入院后48 h 內(nèi)采集外周血進行CRP 檢測，腹腔穿刺術(shù)無菌采集10 ml 腹水進行細菌培養(yǎng)，100 ml 腹水進行流式細胞術(shù)檢測。

1.4 CD64 和CD32 檢測 腹水經(jīng)離心濃縮后以磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2-7.4)調(diào)整細胞數(shù)至(1～2)×106個/ml，50 μm 尼龍篩網(wǎng)過濾，離心濃縮至細胞數(shù)不少于1 ×107個/ml。分別取100 μl 細胞懸液2 管，分別加入以下兩組抗體(所加熒光抗體的體積根據(jù)試劑盒使用說明書進行)，抗體組合為CD45-PerCP+CD64-PE+CD14-FITC 和CD45-Per-CP+CD32-FITC+CD14-FITC，充分混勻，室溫下避光放置20 min，然后加入紅細胞裂解液，避光孵育10min，PBS 洗滌2 次，上機檢測采用側(cè)向角散射光信號(Side scatter，SSC)和CD45 設(shè)門檢測中性粒細胞群CD64、CD32 陽性細胞數(shù)及PMN、Lym、Mo 平均熒光強度(Mean fluorescent intensity，MFI)。采用FCS Express V3 軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計。

1.5 nCD64 和nCD32 指數(shù)計算方法

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 4 統(tǒng)計分析軟件和SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，均值采用t 檢驗，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic curve，ROC)分析CD64、CD32指數(shù)診斷細菌感染的敏感性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 SBP 組與非SBP 組nCD32、nCD64 及CRP 的比較 SBP 組nCD32 為(44 829 ±6 234)mol/cell，nCD64 為(12 942 ±1 698)mol/cell，CRP 為(26.76±4.25)mg/L，WBC 為(11.5 ±2.3)×109L-1;非SBP 組nCD32 為(5 638 ±2 274)mol/cell，nCD64 為(1 028 ±159)mol/cell，CRP 為(3.84 ±0.92)mg/L，WBC 為(5.2 ±1.1)×109L-1，各參數(shù)兩組之間比較均有顯著性差異(P＜0.001)，見表1。

2.2 nCD32、nCD64 和CRP 對于肝硬化并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎鑒別診斷的敏感性和特異性 將SBP組與非SBP 組患者的nCD32 指數(shù)、nCD64 指數(shù)及CRP 值做ROC 曲線，根據(jù)ROC 曲線，計算得出nCD32、nCD64 及CRP 的最佳截斷值分別為(8.39±1.28)、(2.86 ±0.69)、(8.92 ±2.83)mg/L，敏感性分別為:82.8%、96.2%、72.5%，特異性分別為:81.0%、95.8%、73.1%，見表2、圖1。

表1 SBP 組與非SBP 組CD32、CD64 和CRP 的比較Tab.1 Comparison of CD32/CD64/CRP in SBP group and that in non-SBP group

表2 nCD32、nCD64 和CRP 鑒別肝硬化并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎的敏感性和特異性比較Tab.2 Comparison of nCD32/nCD64/CRP in sensitivity and specificity in identification of cirrhotic ascites complicated with SBP

圖1 CD32、CD64 和CRP 鑒別肝硬化并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of nCD32/nCD64/CRP in identification of cirrhotic ascites complicated with SBP

3 討論

SBP 是肝硬化失代償期腹水患者的最主要并發(fā)癥之一。其發(fā)病機制主要是細菌易位，腸道細菌及其產(chǎn)物通過受損的腸黏膜屏障到達血液循環(huán)，出現(xiàn)全身細菌及其產(chǎn)物播散。病死率約20%。所以細菌感染的早期診斷和治療是對臨床醫(yī)生的巨大挑戰(zhàn)，不同原因引起的感染通過臨床癥狀往往很難區(qū)分［7］。對于細菌感染的錯誤判斷會導(dǎo)致治療的延誤，從而引起感染患者的死亡，對于未發(fā)生細菌感染的患者應(yīng)用抗生素不僅無效，還可能導(dǎo)致耐藥、毒副作用、過敏等不良反應(yīng)以及較高的住院費用，因此對于細菌感染臨床上需要一種敏感性和特異性高的具有診斷價值的生物標(biāo)記。

中性粒細胞是急性炎癥反應(yīng)中重要的效應(yīng)細胞，IgG 的Fc 受體(FcγR)能夠激活中性粒細胞發(fā)揮其功能并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，F(xiàn)cγR 通過與IgG 相互作用能夠介導(dǎo)多種免疫原性反應(yīng)［8］。在人體內(nèi)，每個FcγR 都含有3 個結(jié)構(gòu)域，即一個含有2 個FcγRIIa(CD64)或3 個FcγRIa(CD32)的細胞外結(jié)構(gòu)域，一個短的疏水結(jié)構(gòu)域和一個細胞質(zhì)尾，F(xiàn)cγRIIa 是一種結(jié)合于IgG1/3/4 單體的高親和性受體;FcγRIIa(CD32)親和性較低，只作用于IgG 的復(fù)合體或聚集體，CD32 通過IgG 抗體的Fc 識別區(qū)將活化信號傳遞到NK 細胞和髓細胞，從而使先天性免疫和獲得性免疫緊密聯(lián)系在一起［9］。當(dāng)被某些受體觸發(fā)后FcγR 通過免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)連接到酪氨酸蛋白激酶活化的信號通路以調(diào)控細胞代謝和身體機能。FcγRIa 通過與γ 鏈非共價結(jié)合而獲得這種功能，F(xiàn)cγRIIa 則與其他Fc 受體或大多數(shù)免疫受體不同，它們是通過配體結(jié)合鏈連接到ITAM 的［10］。

FcγRI(CD64)是一種分子量為72 kD 的蛋白質(zhì)，只表達于巨噬細胞和樹突狀細胞系中抗原提呈細胞的表面，在正常中性粒細胞表面表達量較低。通過流式細胞儀分析中性粒細胞表面的CD64 被認(rèn)為是一種很好的鑒別細菌感染的診斷方法，nCD64在細菌細胞壁成分、IFN-γ 和G-CSF 等的刺激下表達量急劇升高，如果清除刺激因素或經(jīng)過有效的抗生素治療，CD64 的表達會在48 h 內(nèi)逐漸降低并在7 d 內(nèi)達到正常水平［11］，因此nCD64 的表達量可作為細菌感染患者抗生素治療效果的評價指標(biāo)［12］。另外nCD64 在室溫下可穩(wěn)定保存至少30 h，在4℃可穩(wěn)定保存72 h［13］，同時CD64 分析所需樣本量較小、2 h 內(nèi)可完成、操作簡便，為CD64 作為細菌感染的早期鑒別診斷指標(biāo)奠定基礎(chǔ)。本研究通過檢測并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎的肝硬化患者和未發(fā)生腹水感染的對照組中性粒細胞CD64 指數(shù)發(fā)現(xiàn)，nCD64對診斷SBP 具有很高的敏感度(96.2%)和特異度(95.8%)。說明CD64 的表達是診斷肝硬化SBP 的一個有效標(biāo)志，對SBP 的鑒別診斷、病情判斷、治療效果評價以及預(yù)后評估具有較高的應(yīng)用價值。nCD64 對于是否發(fā)生細菌感染進行鑒別診斷的敏感性和特異性均較高，是一種有效的細菌感染鑒別診斷指標(biāo)。

FcγRII/CD32 是35 年前發(fā)現(xiàn)于造血細胞表面的一種分子量為40 kD 的糖蛋白［12］，能夠?qū)Ⅲw液免疫和細胞免疫聯(lián)系起來，以使免疫球蛋白激活巨噬細胞(吞噬作用)、NK 細胞(ADCC)、中性粒細胞(活化)和B 細胞(抗體提呈)的免疫應(yīng)答。CD32 的表達受TNF-α、Th1 和Th2 類細胞因子的調(diào)節(jié)。INF-γ 和G-CSF 能夠上調(diào)中性粒細胞CD64 的表達，已有研究表明CD64 是新生兒敗血癥的生物標(biāo)記，同時在腹部敗血癥以及需要重癥監(jiān)護的患者體內(nèi)表達量升高［14］。FcγRIIa 在免疫系統(tǒng)中所有類型細胞表面均有表達［15］，如所有的髓細胞、血小板和內(nèi)皮細胞等。有研究表明FcγRIIa 在瘧疾感染的血液期能夠激活單核細胞和巨噬細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答［16，17］。血清CRP 水平是臨床常用的炎癥指標(biāo)，但除細菌感染外，在急性創(chuàng)傷、腫瘤、心肌梗死、結(jié)締組織病等疾病中也會急劇升高，因此血清CRP 水平在細菌感染診斷與鑒別診斷中的特異性較差。本研究發(fā)現(xiàn)，SBP 組與非SBP 組nCD32、nCD64 及CRP 的比較均有顯著性差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，從敏感性及特異性方面來看，腹水nCD64 的敏感性和特異性最高，其次為nCD32，血清CRP 最低，三者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，nCD64 指數(shù)可作為細菌感染診斷的重要指標(biāo)之一，從而更好地指導(dǎo)抗生素的使用，避免濫用抗生素，減少耐藥菌的產(chǎn)生。

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