王菊英 李 鋒 周立榮 唐秀英 李 莉 (寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004)

20 世紀(jì)90 年代以來(lái)，實(shí)驗(yàn)室診斷丙型肝炎病毒(HCV)感染主要利用基因工程表達(dá)的HCV 抗原來(lái)測(cè)定丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)。本實(shí)驗(yàn)室在日常檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，非綜合征型唇腭裂患兒的血清抗-HCV 化學(xué)發(fā)光法(CLIA)有反應(yīng)性樣本的檢出率較高，但均為弱反應(yīng)性，臨床難以明確診斷。由于丙型病毒性肝炎是一種對(duì)患者健康及生命危害較大的疾病，早期明確診斷對(duì)其防治至關(guān)重要。為此本研究通過(guò)以同期、同齡手術(shù)患兒為對(duì)照，對(duì)有反應(yīng)性病例采用免疫印跡法(RIBA)及熒光定量(FQ-PCR)法確證及追蹤監(jiān)測(cè)抗-HCV 來(lái)明確其感染狀態(tài)，并通過(guò)排除高濃度血清免疫球蛋白G(IgG)、類風(fēng)濕因子(RF)及自身抗體(ANA)等常見(jiàn)影響因素來(lái)明確其出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因。以便早期明確診斷，減輕患兒父母的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，避免不必要的醫(yī)患糾紛。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2010 年10 月～2014 年5 月，就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔外科的4 050 例非綜合征型唇腭裂住院患兒作為病例組，女孩1 221例，男孩2 829 例，年齡5 個(gè)月～3.2 歲，平均年齡(1.5 ±0.8)歲。選取同期8 547 例手術(shù)科室住院患兒作為對(duì)照組，其中女孩2 565 例，男孩5 982 例，年齡5 個(gè)月～3.8 歲，平均年齡(1.6 ±0.9)歲，年齡、性別對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.32，P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 儀器和試劑 抗-HCV 檢測(cè)采用強(qiáng)生VITROS3600 分析儀及其配套試劑;RIBA 試劑盒由新加坡MP 公司提供;HCV-RNA 檢測(cè)所用儀器為德國(guó)Rotor-Gene Q 擴(kuò)增儀，試劑盒由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供;血清IgG 及RF 檢測(cè)采用西門子BNII 分析儀及其配套試劑;ANA 檢測(cè)試劑盒由歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)程序 先采用CLIA 檢測(cè)抗-HCV，有反應(yīng)性病例采用RIBA 及FQ-PCR 確證;病例組有反應(yīng)性病例采用CLIA 法進(jìn)行3 個(gè)月、6 個(gè)月、12 個(gè)月及以上抗-HCV 追蹤監(jiān)測(cè)至轉(zhuǎn)陰，分析比較其轉(zhuǎn)陰前后血清IgG、RF 及ANA 的檢測(cè)結(jié)果的差異。

1.3.2 質(zhì)量保證 方法學(xué)進(jìn)行了性能驗(yàn)證;室內(nèi)質(zhì)控在控;分析程序嚴(yán)格執(zhí)行各儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)及檢測(cè)項(xiàng)目SOP，標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、保存均嚴(yán)格執(zhí)行相應(yīng)SOP;-20℃保存樣本檢測(cè)時(shí)恢復(fù)室溫后充分混勻;有反應(yīng)性樣本離心后復(fù)檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，樣本率應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料應(yīng)用t 檢驗(yàn)，均以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組病例抗-HCV 篩查及確認(rèn)結(jié)果比較 病例組抗-HCV 有反應(yīng)性檢出率為(1.07%)高于對(duì)照組(0.2%)，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.4，P＜0.05);病例組抗-HCV 假陽(yáng)性率為(100%)高于對(duì)照組(88.2%)，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.57，P＜0.05)，具體見(jiàn)表1。

2.2 病例組42 例有反應(yīng)性病例臨床資料 42 例有反應(yīng)性病例及母親均無(wú)輸血史，母親抗-HCV 均為陰性;乙肝全套(HBV-M)檢測(cè)結(jié)果:HBV-M(-)8例，抗-HBs(+)28 例，抗-HBS(+)+抗-HBc(+)4例(與其母結(jié)果相同)，抗-HBs(+)+抗-HBe(+)+抗-HC(+)2 例(與其母結(jié)果相同);肝功能(AST/ALT)異常有14 例。

2.3 病例組有反應(yīng)性病例抗-HCV 追蹤監(jiān)測(cè)結(jié)果經(jīng)1 個(gè)月～19 個(gè)月追蹤監(jiān)測(cè)均轉(zhuǎn)為陰性，轉(zhuǎn)陰時(shí)間隨S/CO 值增大而延長(zhǎng)，具體見(jiàn)圖1。

2.4 病例組42 例有反應(yīng)性病例轉(zhuǎn)陰前后相關(guān)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 轉(zhuǎn)陰前后IgG 測(cè)定結(jié)果最高值均未超出生物參考區(qū)間(7.16 g/L)上限，轉(zhuǎn)陰前后比對(duì)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.71，P ＞0.05)，RF 轉(zhuǎn)陰前后所有測(cè)定值均為10.7 U/ml，ANA 均為陰性，具體見(jiàn)表2。

表1 兩組病例HCV 感染篩查及確證結(jié)果Tab.1 Results of HCV infective screening and confirming test

表2 42 例有反應(yīng)性病例轉(zhuǎn)陰前后檢測(cè)結(jié)果(IgG，±s)Tab.2 Results of 42 reactive cases during transformation(IgG，±s)

表2 42 例有反應(yīng)性病例轉(zhuǎn)陰前后檢測(cè)結(jié)果(IgG，±s)Tab.2 Results of 42 reactive cases during transformation(IgG，±s)

圖1 唇腭裂患者抗-HCV S/CO 值與所需轉(zhuǎn)陰時(shí)間關(guān)系Fig.1 Relation between anti-HCV S/CO and time to be negative in cleft lip and palate patients

3 討論

CLIA 是將具有高度敏感的化學(xué)發(fā)光測(cè)量技術(shù)與高度特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)。應(yīng)用CLIA 檢測(cè)血清抗-HCV 敏感、特異、穩(wěn)定性好，適合臨床推廣應(yīng)用［1］。但本研究42 例抗-HCV 弱反應(yīng)性非綜合征型唇腭裂病例經(jīng)RIBA 及HCVRNA 檢測(cè)均為陰性，所以抗-HCV 檢測(cè)弱反應(yīng)性并不能確診丙肝，應(yīng)同時(shí)加做RIBA 試驗(yàn)［2，3］或進(jìn)行HCVRNA檢測(cè)［4］。

關(guān)于HCV 抗體檢測(cè)的影響因素，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道大多針對(duì)ELISA 方法，而化學(xué)發(fā)光法的影響因素報(bào)道很少，ELISA 影響因素主要有［5-7］:樣本溶血、脂血、黃疸、凝固不全等外源性因素;操作影響;內(nèi)源性物質(zhì)干擾，如類風(fēng)濕因子、高濃度免疫球蛋白、自身抗體、超氧化物歧化酶等;試劑抗原不純、多克隆抗體和酶結(jié)合物純度低等。本研究依據(jù)以上影響因素，對(duì)非綜合征型唇腭裂患兒抗-HCV CLIA 法出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因進(jìn)行了求證。

(1)外源性及操作因素。本研究抗-HCV 檢測(cè)所使用儀器為VITROS3600 全自動(dòng)酶免分析儀，有經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專業(yè)人員操作，儀器使用前進(jìn)行了性能驗(yàn)證，檢測(cè)及維護(hù)保養(yǎng)均嚴(yán)格執(zhí)行相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，每日進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測(cè)。另外，該分析儀具有INTELLICHECK 技術(shù)，可有效監(jiān)測(cè)樣本性狀(溶血、凝固不全、脂血)、樣本及試劑加樣量、洗滌程度、孵育溫度等整個(gè)分析過(guò)程，故可避免加樣不準(zhǔn)確、孵育溫度有波動(dòng)、時(shí)間不精確等系統(tǒng)誤差，同時(shí)弱反應(yīng)性樣本均進(jìn)行了離心后復(fù)檢，因此有效避免了偶然誤差。

(2)針對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，本研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)陰前后血清IgG、RF 及ANA 比對(duì)，對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，說(shuō)明假陽(yáng)性的影響因素不在研究范圍。也有文獻(xiàn)報(bào)道高滴度抗HBc-IgG 致抗-HCV測(cè)定結(jié)果假陽(yáng)性［8］，但本研究中HBc-IgG 陽(yáng)性病例僅為14.3%(6/42)，且其血清IgG 均未超出生物參考區(qū)間上限，不至于造成假陽(yáng)性。

(3)試劑本身的原因。本研究病例組假陽(yáng)性率為100%，對(duì)照組假陽(yáng)性率為88.2%(兩組病例有反應(yīng)性樣本S/CO 值均＜8)，這與王正芳等報(bào)道［9］當(dāng)S/CO 值＜12 時(shí)，所有檢測(cè)樣本經(jīng)RIBA 確證陽(yáng)性率僅為6.5%基本一致，說(shuō)明CLIA 法弱反應(yīng)性樣本中存在大量假陽(yáng)性，這可能與抗原、多克隆抗體或酶結(jié)合物純度低等有關(guān)［9］。但病例組抗-HCV 有反應(yīng)性檢出率及假陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，又說(shuō)明他們之間引起假陽(yáng)性的影響因素還是存在一定的差異。有文獻(xiàn)報(bào)道非綜合征性唇腭裂患者和正常人的血漿代謝存在差異［10，11］，宋具昆等［10］研究認(rèn)為至少存在3 種以上的不同的代謝產(chǎn)物，分別為三羥丁酸甲基類物質(zhì)、精氨酸和纈氨酸等。非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝產(chǎn)物以纈氨酸和三羥丁酸甲基類物質(zhì)為主，而正常人血漿代謝產(chǎn)物則以精氨酸為主;黃光磊等［11］研究表明至少存在4 種不同代謝產(chǎn)物，分別為天門冬素、門冬氨酸、肌酐、脯氨酸、膽堿、絡(luò)氨酸。非綜合征型唇腭裂患者血漿代謝產(chǎn)物以天門冬素、門冬氨酸及絡(luò)氨酸為主，而正常人血漿代謝產(chǎn)物以膽堿、肌酐及脯氨酸為主。雖然非綜合征型唇腭裂病例較易出現(xiàn)抗-HCV 假陽(yáng)性的原因尚不清楚，試想是否可歸因于他們的代謝產(chǎn)物與HCV 抗原存在相似的表位，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體與試劑HCV 抗原發(fā)生了交叉反應(yīng)?抑或是這些異常蛋白質(zhì)干擾了CLIA 反應(yīng)?經(jīng)過(guò)手術(shù)矯正康復(fù)后其血漿代謝恢復(fù)正常致抗-HCV 轉(zhuǎn)陰?確切的原因尚待進(jìn)一步研究。為什么不是所有非綜合征型唇腭裂病例均為抗-HCV CLIA有反應(yīng)性呢?其因?yàn)槊庖邔W(xué)反應(yīng)中只有抗原抗體比例合適時(shí)才能呈現(xiàn)有反應(yīng)性。

鑒于非綜合征性唇腭裂患兒抗-HCV CLIA 弱反應(yīng)性樣本中存在大量的假陽(yáng)性，故實(shí)驗(yàn)室在結(jié)果報(bào)告時(shí)要慎重，尤其遇到像研究病例中的14 例肝功能異常的有反應(yīng)性病例，檢測(cè)者很容易將其作為實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)報(bào)告為陽(yáng)性。中國(guó)社科院發(fā)布報(bào)告指出我國(guó)中西部和農(nóng)村醫(yī)療資源與東部相比差距較大［12］，中西部一些邊遠(yuǎn)或經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)還沒(méi)有條件開展RIBA 和HCV RNA 試驗(yàn)。不過(guò)，本研究42 例抗-HCV弱反應(yīng)性病例經(jīng)1 個(gè)月～19 個(gè)月追蹤監(jiān)測(cè)均轉(zhuǎn)為陰性，表明如果檢測(cè)結(jié)果S/CO 值＜8.0、患者無(wú)輸血史、垂直傳播史、乙型肝炎病毒感染史等，對(duì)其進(jìn)行血清抗-HCV 追蹤監(jiān)測(cè)無(wú)疑是切實(shí)可行的辦法。

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