趙振安 戴 吉 趙婉君 王青云 曹忠勝 (蘇州大學附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，蘇州 215004)

變應性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是特應性個體接觸變應原后由IgE 介導的介質(zhì)釋放，并有多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應性疾?。?］。目前，特異性免疫治療(Specific immunotherapy，SIT)是唯一對因治療AR 的方法，其臨床治療周期長，患者依從性差，機理也不完全清楚［2］。因此，尋找快速可行的SIT 方法是非常必要的。本研究通過建立AR 動物模型用腹股溝皮下注射方法進行SIT，以期縮短SIT 周期，探討其可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 卵清蛋白(OVA)，購自美國Sigma公司;氫氧化鋁凝膠，購自Thermo 公司;小鼠IL-4和IFN-γ ELISA 試劑盒，購自ebioscience 公司;小鼠OVA-sIgE ELISA 試劑盒購自Cusabio 公司。

1.2 動物 36 只清潔級雌性BALB/c 小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量16.5～17.2 g，購自蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司(SCXK 2009-0001)。

1.3 建立模型 參照Zheng 等［3］的方法建立AR模型，然后進行治療。將小鼠隨機分為6 組，分別為A 空白組，A 模型組，A 治療組，B 空白組，B 模型組，B 治療組(A 為腹股溝皮下注射，B 為頸背部皮下注射)。致敏階段:模型組和治療組，每組給予0.1 mg OVA+2 mg 氫氧化鋁凝膠，用生理鹽水共配成0.3 ml，分別在0、7、14 d 進行腹腔注射，空白組用等體積生理鹽水進行腹腔注射。第21～24 天進行鼻腔激發(fā)，空白組用20 μl 生理鹽水激發(fā)，其余各組都用0.4 mg OVA 溶于20 μl 的生理鹽水進行激發(fā)。第25～55 天，隔天一次，共15 次，脫敏治療。A 治療組給予0.5 mg 的OVA，溶于0.1 ml 的生理鹽水進行腹股溝皮下注射。B 治療組給予0.5 mg的OVA，溶于0.1 ml 的生理鹽水進行頸背部皮下注射。A 空白組和模型組腹股溝皮下注射等體積的生理鹽水，B 空白組和模型組頸背部皮下注射等體積的生理鹽水。頸背部注射方法:將小鼠頸背部皮膚提起形成一個窩，然后于形成的窩處45°角進針，回抽無血即可推注。腹股溝注射方法:將小鼠腹股溝皮膚提起，約45°角進針，有落空感，回抽如無血液即可推注。第56～62 天進行鼻腔激發(fā)，除空白組用等體積生理鹽水激發(fā)外其余各組溶于20 μl 生理鹽水的0.4 mg 的OVA 進行激發(fā)。治療的劑量和時間是綜合其他研究者的方法選取的［4-7］。治療期間所有小鼠狀態(tài)良好，無一死亡。

1.4 癥狀評分 用移液器將OVA 溶液滴于雙側(cè)前鼻孔，每側(cè)10 μl，維持致敏狀態(tài)，每次鼻腔致敏后10 min 內(nèi)，記錄小鼠鼻涕量、噴嚏次數(shù)及搔鼻情況，按照鼻炎癥狀評分標準來評價小鼠是否有發(fā)生變應性鼻炎。(1)鼻癢:輕度，輕擦鼻幾次，1 分;重度，撓鼻面不止，到處擦磨，3 分;介于兩者之間，2 分;(2)噴嚏:1～3 個1 分，4～10 個2 分，11 個以上3 分;(3)清涕:流至前鼻孔1 分，超過前鼻孔2 分，流涕滿面3 分;采用疊加量化計分法計分［8］。

1.5 標本采集 最后一次激發(fā)24 h 后進行取材。麻醉后摘除眼球放血，進行鼻腔灌洗，每只用1 ml 生理鹽水。保留灌洗液;取鼻中隔黏膜，液氮保存。血液室溫靜置1～2 h 后，3 000 r/min，離心15 min，取上清。鼻腔灌洗液，12 000 r/min，離心5 min，取上清。所有上清立即凍于-80℃冰箱。鼻黏膜取出后立即固定于4%的多聚甲醛，4℃，48 h，石蠟包埋，切片。

1.6 HE 染色和變色酸2R 染色［9］HE 染色觀察小鼠鼻黏膜組織學狀況，變色酸2R 染色可以特異性的將EOS 的胞漿染成粉紅或鮮紅色［9］，方便計數(shù)EOS。對小鼠鼻黏膜EOS 變色酸2R 染色分別選取5 個高倍鏡(×100)視野，進行EOS 計數(shù)。

1.7 ELISA 實驗 ELISA 法檢測血清OVA-sIgE、鼻腔灌洗液IL-4 和IFN-γ 的濃度，并計算IFN-γ 與IL-4 的比率。

1.8 統(tǒng)計學處理 用SPSS17.0 進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s 表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本的t 檢驗，三組或三組以上均數(shù)比較采用F 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀評分 小鼠AR 癥狀評分。未治療前，A模型組、B 模型組和治療組小鼠激發(fā)后第2 天開始出現(xiàn)明顯的噴嚏、抓撓鼻和流涕癥狀，總分大于5分，表明造模成功。對照組都無典型癥狀，偶有抓撓表現(xiàn)，總分小于5 分。治療之后激發(fā)，第5 天開始A模型組、B 模型組和B 治療組出現(xiàn)明顯的噴嚏、抓撓鼻和流涕癥狀，A 治療組癥狀比較輕。第7 天，記錄鼻腔激發(fā)后10 min 內(nèi)，小鼠鼻涕量、噴嚏次數(shù)及搔鼻情況，進行記分。結(jié)果顯示，A 治療組小鼠的癥狀明顯改善，評分小于5 分。前后兩次分別記錄小鼠癥狀評分數(shù)(見圖1)。

2.2 鼻黏膜的HE 染色和變色酸2R 染色 HE 染色觀察鼻黏膜基本組織學狀態(tài)，見圖2。變色酸2R染色可以特異性的對EOS 進行染色，以便計數(shù)，見圖3。

2.3 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 的計數(shù) 見表1和圖4。模型組與空白組相比，P＜0.05，差異

分別都有統(tǒng)計學意義，說明AR 建模是成功的;A 治療組與A 模型組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明腹股溝皮下注射法有效;B 治療組與B 模型組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義，說明背部皮下注射法效果不佳。

圖1 小鼠的癥狀評分Fig.1 Symptom scores were documented in mice

圖2 顯微鏡下鼻黏膜HE 染色(×40)Fig.2 Hematoxylin-eosin(HE)staining(×40)

圖3 顯微鏡下鼻黏膜變色酸2R 染色(×100)Fig.3 Dye of chromotropic acid 2R(×100)

表1 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 計數(shù)(±s)Tab.1 Count of EOS in nasal mucosa of mice after dye of chromotropic acid 2R(±s)

表1 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 計數(shù)(±s)Tab.1 Count of EOS in nasal mucosa of mice after dye of chromotropic acid 2R(±s)

Note:Model group compared with the control group，1)P＜0.05;Treatment A group compared with the model A group，2)P＜0.05.There was no difference between treatment B group and model B group.

表2 各組小鼠血清中OVA-sIgE 的OD 值(±s)Tab.2 OD value of OVA-sIgE in mice serum(±s)

表2 各組小鼠血清中OVA-sIgE 的OD 值(±s)Tab.2 OD value of OVA-sIgE in mice serum(±s)

Note:The OVA-sIgE concentration of control groups showed negative，other showed positive.

表3 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 和IFN-γ 的濃度及IFN-γ/IL-4 的比值(±s)Tab.3 Concentration of IL-4 and IFN-γ in nasal lavage in mice，ratio of interferon-γ and interleukin-4(±s)

表3 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 和IFN-γ 的濃度及IFN-γ/IL-4 的比值(±s)Tab.3 Concentration of IL-4 and IFN-γ in nasal lavage in mice，ratio of interferon-γ and interleukin-4(±s)

Note:Model group compared with the control group，1)P＜0.05;treatment A group compared with the model A group，2)P＜0.05.There was no difference between treatment B group and model B group.

2.4 小鼠外周血OVA-sIgE 在各組之間的變化趨勢見表2。

2.5 小鼠鼻腔灌洗液IL-4 和IFN-γ 的水平 見表3 和圖5～7。A、B 模型組各項指標差異甚小，差異沒有統(tǒng)計學意義。A 治療組與A 模型組相比，IL-4和IFN-γ 濃度明顯的降低，IFN-γ/IL-4 的比值明顯的升高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明腹股溝皮下治療有效。而B 治療組與B 模型組相比，各項指標差異非常小，差異沒有統(tǒng)計學意義，說明背部皮下治療效果不佳。

圖4 小鼠鼻黏膜EOS 計數(shù)Fig.4 Count of EOS in nasal mucosa of mice

圖5 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 的濃度Fig.5 Concentration of IL-4 in nasal lavage

圖6 各組小鼠鼻腔灌洗液中IFN-γ 的濃度比較Fig.6 Concentration of IFN-γ in nasal lavage

圖7 IFN-γ/IL-4 的比值Fig.7 Ratio of interferon-γ and interleukin-4

3 討論

AR 嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，目前，SIT 是唯一可改變AR 自然進程的對因治療方法。但SIT周期需要3～5 年，患者常常不能堅持治療，所以希望有更好的治療方法，既有效療程又短。

應用動物模型是快捷研究AR 的SIT 的重要途徑。目前比較成熟的AR 動物模型是OVA 致敏模型［10］。常見的OVA-SIT 方法包括頸背部皮下注射治療，例如，Yoon-Seok 等［11］在研究小鼠背部皮下免疫治療適宜的時間和劑量時證明，小鼠在OVA 320 μg/次，治療16～24 次時治療效果和安全性比較好，而超過OVA 600 μg/次時部分小鼠不太活躍;舌下含服治療，例如Mascarell 等［12］研究小鼠巨噬樣細胞在舌下免疫治療中的作用，模型建立方法是將小鼠麻醉后給予舌下含服OVA 500 μg/次，治療16 次。頸背部皮下治療方式相對比較簡單，但治療周期長;舌下含服治療，需要將動物麻醉，然后舌下給藥，整個過程比較繁瑣，需要掌握好麻醉劑的用量，而且舌下含服變應原的利用率不穩(wěn)定，可能會被隨時吞咽，治療時間也長。目前，對于AR 的SIT，腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)注射法逐漸得到認可，例如Gabriela Senti 等［13］對貓過敏的AR 患者腹股溝淋巴管內(nèi)注射變應原提取液進行SIT，分3 次進行，每月一次，治療后患者癥狀明顯好轉(zhuǎn)。但是需要超聲的引導才能進行，操作較困難，至于起效的原理還不清楚，只能推測與淋巴結(jié)有關，可能由于免疫反應發(fā)起在二級淋巴器官(Secondary lymphoid organs，SLOs)，包括淋巴結(jié)、脾白髓和組織與黏膜相關淋巴組織器官。SLOs 突出的特點是它們能夠幫助免疫細胞建立一個有效的免疫應答［14］。所以我們推測腹股溝淋巴管和淋巴結(jié)豐富，進行腹股溝皮下注射后變應原會較快達到淋巴結(jié)進而較快產(chǎn)生療效。綜合其他研究者頸背部皮下注射和舌下含服治療的用藥劑量，我們進行了頸背部和腹股溝皮下注射治療。其中，IgE是判斷AR 的標志性因子;EOS 是AR 主要效應細胞，EOS 浸潤的多少可以間接判斷AR 的嚴重程度;IFN-γ 是Th1 細胞標志性的因子，IL-4 是Th2 標志性的細胞因子，正常情況下，Th1/Th2 處于平衡狀態(tài)，當發(fā)生AR 時，兩者之間的比例失衡，即Th2 ＞Th1。而SIT 治療AR 的基本原理就是通過抑制Th2免疫反應和刺激Th1 免疫反應，達到治療目的。所以通過檢測IL-4/IFN-γ 的比值，可以反映SIT 的效果［15，16］。

本實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠的AR 癥狀評分大于5，血清中OVA-sIgE 和IL-4 明顯增高而IFN-γ 明顯下降，并且鼻黏膜EOS 數(shù)明顯增加，具有明顯的Th2 反應優(yōu)勢，表明AR 建模成功。OVA 免疫治療30 d 后，A 治療組小鼠癥狀評分小于5，而B 治療組癥狀評分仍大于5，說明A 治療比B治療有效且起效時間快。相對于模型組和B 治療組，A 治療組小鼠血清中IFN-γ/IL-4 的比值明顯增高，變色酸2R 染色EOS 計數(shù)出現(xiàn)明顯減少，差異有明顯的統(tǒng)計學意義，說明A 治療有效抑制了Th2 免疫反應而刺激了Th1 免疫反應，達到了治療目的。A 治療組效果比較好的原因可能是腹股溝淋巴管和淋巴結(jié)豐富，變應原會較快吸收達到SLOs 產(chǎn)生免疫應答，相對縮短了治療時間，而B 治療組變應原的注射部位遠離淋巴結(jié)，所以起效慢。

綜上所述，腹股溝皮下注射免疫治療小鼠變應性鼻炎效果好，周期短，操作簡單，可行性好，是特異性免疫治療小鼠變應性鼻炎的一種新方法。

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