陳清嬌 曾志勇 邱東飚 陳君敏 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福州350005)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)為血液系統(tǒng)漿細(xì)胞惡性腫瘤，多見于老年人。MM 仍是一種無法治愈的疾病，雖然20 年來由于干細(xì)胞移植的應(yīng)用和諸如硼替佐米、雷那度胺和沙利度胺等新藥的出現(xiàn)，MM 的生存有很大的改觀。骨髓瘤骨病(Myeloma bone disease，MBD)是MM 患者常見并發(fā)癥，表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞、病理性骨折、高鈣血癥和神經(jīng)壓迫癥狀，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［1］。

由于單核細(xì)胞在RANKL 和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)誘導(dǎo)下可分化為參與MBD 發(fā)生發(fā)展的OC，目前普遍將其作為OC 的前體［2］。然而，近年有研究發(fā)現(xiàn)，M-CSF 與RANKL 可誘導(dǎo)參與免疫調(diào)節(jié)的未成熟樹突狀細(xì)胞(Immature dendritic cells，imDC)轉(zhuǎn)分化為具有骨吸收作用的OC，并且imDC 較單核細(xì)胞更易融合為多核的OC，認(rèn)為imDC 是比單核細(xì)胞更接近OC 的前體細(xì)胞。此外，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)在MM 骨髓微環(huán)境下，imDC 可轉(zhuǎn)分化為OC，因此這一轉(zhuǎn)分化過程可能在MBD 的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［3］。

γδ T 細(xì)胞為表達(dá)γδ TCR 的特殊T 細(xì)胞亞群，具有抗原特異性識別而無MHC 限制性，在感染、腫瘤及自身免疫性疾病中起著重要作用［4］。先前的研究證實(shí)健康人及多種腫瘤患者外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMNC)經(jīng)唑來膦酸(Zoledronate，Zol)刺激及重組人白細(xì)胞介素2(Interleukin-2，IL-2)擴(kuò)增可獲得高純度的γδ T 細(xì)胞，后者可促進(jìn)imDC 的成熟［5］，因此γδ T 細(xì)胞可能在imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 過程中發(fā)揮作用。

因此，本研究旨在體外條件下探討MM 患者與健康志愿者體外激活擴(kuò)增γδ T 細(xì)胞的差異，并進(jìn)一步研究體外擴(kuò)增的γδ T 細(xì)胞對imDC 轉(zhuǎn)分化為OC過程的影響，為γδ T 細(xì)胞用于免疫治療MBD 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Zol 購自恒瑞公司，重組人M-CSF、重組人RANKL、GM-CSF、IL-4、IL-2 為Peprotech 公司產(chǎn)品，人淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司，抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP 染色試劑盒、甲苯胺藍(lán)染液購自Sigma 公司，牙本質(zhì)片購自Immunodiagnostic Systems 公司，抗CD51/61 抗體、抗CD1a、CD3 和γδTCR 抗體購自eBioscience 公司，CD14+、γδ TCR 陽性分選免疫磁珠購自Miltenyi 公司，人TNF-α ELISA 試劑盒購自RayBio 公司。流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter FC-500。

1.2 方法

1.2.1 γδ T 細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定 采集MM 患者或健康志愿者外周血10 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離獲取PBMNC，接種于24 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為(1～2)×106個/ml，在培養(yǎng)當(dāng)日加入Zol(終濃度為1 μm)和IL-2(終濃度為100 U/ml)或僅加入IL-2(終濃度為100 U/ml)，在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每3 d 一次半量換液，并加入含IL-2 100 U/ml 的10 % FBS RPMI1640 新鮮培養(yǎng)液重懸繼續(xù)培養(yǎng)。收集培養(yǎng)前后細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，分別加入5 μl 抗CD3-FITC 與γδ TCR-PE 抗體混勻，用抗鼠IgG 單克隆抗體做同型對照;室溫避光孵育20 min，加入2 ml PBS 洗滌1 次，重懸于500 μl的PBS，流式細(xì)胞儀檢測CD3/γδ TCR 表達(dá)情況。

1.2.2 imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 的體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 淋巴細(xì)胞分離液分離健康志愿者外周血以獲取PBMNC，免疫磁珠分選出CD14 陽性細(xì)胞后，接種于24 孔培養(yǎng)板(細(xì)胞數(shù)為5 ×105個/孔)，加入GM-CSF(終濃度為150 ng/ml)和IL-4(終濃度為50 ng/ml)，在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以后每2～3 d換液，并加入含上述濃度的細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)第5～6 天收集細(xì)胞，用含M-CSF(25 ng/ml)和RANKL(100 ng/ml)的10% FBS α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，以后每2 d 換液，并加入含上述濃度的細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)前后CD14、CD1a 和CD51/61 的表達(dá)情況。

1.2.3 γδ T 細(xì)胞體外對imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 的影響 收集imDC 細(xì)胞，含M-CSF(25 ng/ml)和RANKL(100 ng/ml)的10%FBS α-MEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×105ml-1，置于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，免疫磁珠分選方法分選培養(yǎng)至第7 天的γδ T 細(xì)胞，含M-CSF(25 ng/ml)和RANKL(100 ng/ml)的10%FBS α-MEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 106ml-1，置于millicell 小室內(nèi)，即上室為γδ T 細(xì)胞，下室為imDC，二者細(xì)胞比為10∶1，于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱共培養(yǎng)。設(shè)立imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組、γδ T 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組為對照組。于共培養(yǎng)第7 天、14天分別進(jìn)行TRAP 染色及甲苯胺藍(lán)染色以了解不同培養(yǎng)組OC 生成情況。

1.2.4 細(xì)胞因子檢測 收集γδ T 細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)組、γδ T 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組及imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組第7 天的培養(yǎng)上清，采用ELISA 檢測培養(yǎng)上清中TNF-α 實(shí)驗(yàn)按照ELISA 試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0 軟件，數(shù)據(jù)采用±s 表示。采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t 檢驗(yàn)比較健康志愿者與MM 患者外周血γδ T 細(xì)胞擴(kuò)增純度差異及Zol 聯(lián)合IL-2 擴(kuò)增的γδ T 細(xì)胞與單用IL-2 擴(kuò)增的γδ T 細(xì)胞純度差異;其余均采用單向方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康志愿者外周血γδ T 細(xì)胞體外擴(kuò)增 3 名健康志愿者來源PBMNC 分別經(jīng)Zol 聯(lián)合IL-2、單用IL-2 刺激誘導(dǎo)γδ T 細(xì)胞生成，流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)第7 天細(xì)胞CD3 和γδ TCR 表達(dá)，CD3+γδ TCR+的細(xì)胞百分比分別為69.33% ±16.84%和29.50% ±5.8%(P＜0.05)(圖1)。

2.2 MM 患者與健康志愿者外周血γδ T 細(xì)胞體外擴(kuò)增

2.2.1 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)過程形態(tài)變化 PBMNC 加入Zol 和IL-2 培養(yǎng)第1 天，細(xì)胞為非貼壁生長，可見細(xì)胞分散分布，少部分細(xì)胞聚集成團(tuán)狀;隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞團(tuán)狀生長數(shù)目增多，團(tuán)塊增大，單個散在生長的細(xì)胞觀察可見較為明顯的細(xì)胞突起，MM 患者與健康志愿者來源的PBMNC體外誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)相仿(圖2)。

2.2.2 MM 患者與健康志愿者γδ T 細(xì)胞體外擴(kuò)增純度鑒定 3 例MM 患者和3 名健康志愿者來源的PBMNC 經(jīng)Zol 和IL-2 刺激誘導(dǎo)γδ T 細(xì)胞生成，流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)第7 天細(xì)胞CD3 和γδ TCR 表達(dá)，CD3+γδ TCR+的細(xì)胞百分比分別為68.87% ±20.94%和69.33% ±16.84%，兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)(圖3)。

2.3 imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.3.1 倒置相差顯微鏡觀察imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)過程細(xì)胞形態(tài)變化 接種24 h 后貼壁的PBMNC 大小均勻一致，呈圓形，部分呈單個分散分布，部分聚集成團(tuán);培養(yǎng)3 d 時以單核細(xì)胞數(shù)量居多，胞體增大，形態(tài)多為圓形或橢圓形，可見梭狀突起;于第6 天誘導(dǎo)imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 過程中，細(xì)胞可隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長，呈類圓形、梭形、漏斗形或不規(guī)則形的細(xì)胞增多，胞體逐漸增大，部分細(xì)胞含多個細(xì)胞核，胞質(zhì)可見大小不等的空泡，部分細(xì)胞可見偽足樣結(jié)構(gòu)(圖4)。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)PBMNC 分化為OC 過程CD14、CD1a 及CD51/61 表達(dá)情況 流式結(jié)果顯示新分離的PBMNC可表達(dá)CD14，經(jīng)免疫磁珠分選可獲得較高純度的CD14+細(xì)胞，PBMNC 低表達(dá)或不表達(dá)CD1a;經(jīng)GM-CSF 及IL-4 細(xì)胞因子作用培養(yǎng)6 d 后，相比于誘導(dǎo)前，CD14 表達(dá)量降低，而CD1a表達(dá)量增高;imDC 誘導(dǎo)為OC 前可低表達(dá)CD51/61，經(jīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為OC 細(xì)胞后表達(dá)CD51/61 量增多(圖5)。

圖1 不同方法γδ T 細(xì)胞培養(yǎng)后γδ T 細(xì)胞的陽性率比較Fig.1 γδ T positive cells with different stimulator

圖2 倒置相差顯微鏡觀察MM 患者與健康志愿者γδ T細(xì)胞體外培養(yǎng)過程形態(tài)變化Fig.2 Photomicrographs of γδ T cells from MM and healthy volunteers during culture period

2.4 γδ T 細(xì)胞-imDC 間接共培養(yǎng)條件下γδ T 細(xì)胞對imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 過程的影響

2.4.1 倒置顯微鏡下不同培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)變化 γδ T 細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)第1 天，共培養(yǎng)組較imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞突起較少，未見γδ T 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組中的細(xì)胞集落，且隨著培養(yǎng)時間的延長，差距越明顯;至培養(yǎng)第7 天，鏡下可見共培養(yǎng)組部分細(xì)胞體積較大，少部分可見細(xì)胞突起，相較于imDC單獨(dú)培養(yǎng)組少，而γδ T 細(xì)胞培養(yǎng)組可見細(xì)胞成集落狀生長(圖6)。

2.4.2 TRAP 染色結(jié)果和不同培養(yǎng)組TRAP +多核細(xì)胞數(shù)目差異 取培養(yǎng)至第14 天的細(xì)胞爬片進(jìn)行TRAP 染色，細(xì)胞核≥3 個為OC，低倍鏡下計(jì)數(shù)10個視野OC 數(shù)目，取每一視野平均細(xì)胞數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，比較Zol 和IL-2 聯(lián)合刺激培養(yǎng)的γδ T 細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)組與IL-2 單獨(dú)刺激培養(yǎng)的γδ T 細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)組和imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組OC 數(shù)目差異，分別為5.67 ±0.58 個、17.00 ±2.00 個和28.33 ±2.08 個，各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖7)。IL-2 組體外擴(kuò)增的γδ T 細(xì)胞對imDC 轉(zhuǎn)分化過程的抑制作用較Zol 和IL-2 聯(lián)合刺激組弱。

圖3 γδ T 細(xì)胞培養(yǎng)前后γδ T 細(xì)胞的陽性率Fig.3 γδ T positive cells before(A)and after culture(B)

圖4 倒置顯微鏡下imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 過程的細(xì)胞形態(tài)變化(×400)Fig.4 Photomicrographs of imDC during differentiating into OC(×400)

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)過程CD14、CD1a 及CD51/61 的表達(dá)Fig.5 CD14，CD1a and CD51/61 expression of cultured cells measured in flow cytometry

2.4.3 不同培養(yǎng)組OC 骨吸收作用 取培養(yǎng)至第21 天的牙本質(zhì)片，甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示γδ T 細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)體系未見著色或僅少量著色部位，imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組可見多處形狀不規(guī)則著色部位。采用Image J 圖像分析軟件計(jì)算γδ T 細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)和imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組牙本質(zhì)片骨吸收面積百分比，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，分別為4.97% ±4.3%和28.47% ±12.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖8)。

圖6 倒置顯微鏡下各培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)變化Fig.6 Photomicrographs of cells of different groups

圖7 不同培養(yǎng)組TRAP 染色結(jié)果Fig.7 Tartrate resistant acid phosphatase staining of different groups

圖8 培養(yǎng)至第21 天牙本質(zhì)片甲苯胺藍(lán)染色Fig.8 Dentin toluidine blue staining on d21

2.5 ELISA 方法檢測不同培養(yǎng)組培養(yǎng)上清中TNFα 的差異 結(jié)果顯示在γδ T 細(xì)胞存在的培養(yǎng)條件下，TNF-α 水平較高，γδ T 細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)TNF-α 濃度較γδ T 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組高，P＜0.001［分別為(68.61 ±3.11)pg/ml 和(36.61 ±2.03)pg/ml］，較imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組高，P＜0.001［分別為(68.61 ± 3.11)pg/ml 和(50.30 ± 4.04)pg/ml］，γδ T 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組TNF-α 濃度較imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組低，P＜0.001［分別為(36.61 ±2.03)pg/ml 和(50.30 ±4.04)pg/ml］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

MM 為血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤，溶骨性骨破壞為其標(biāo)志性特征之一，區(qū)別于血液系統(tǒng)其他腫瘤類別，臨床上多表現(xiàn)為溶骨性改變，嚴(yán)重影響MM 患者的預(yù)后及生存質(zhì)量［6］。MBD 的相關(guān)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究認(rèn)為OC 與MM 細(xì)胞相互作用形成骨破壞和腫瘤的進(jìn)展、惡化的惡性循環(huán)對MM 患者發(fā)生溶骨性改變起關(guān)鍵作用［7］。不僅MM 細(xì)胞及其周邊細(xì)胞包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞可分泌OC 活化因子促進(jìn)OC 的形成與活化，而且OC 與MM 瘤細(xì)胞相互作用可抑制腫瘤細(xì)胞自身凋亡并促進(jìn)瘤細(xì)胞增長。本實(shí)驗(yàn)組成員前期研究證實(shí)OC 活性增強(qiáng)和成骨細(xì)胞發(fā)育障礙共同參與MBD 的發(fā)生［8，9］?？梢?，OC 在MBD 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，研究抑制OC 的生成與活化成為目前治療MBD 的焦點(diǎn)。

傳統(tǒng)認(rèn)為，OC 來源于單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，最近研究發(fā)現(xiàn)imDC 在RANKL 及M-CSF 的誘導(dǎo)下可轉(zhuǎn)分化為具有骨吸收功能的OC，且該途徑較單核-巨噬細(xì)胞來源途徑更有效［2］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究采用外周血單個核細(xì)胞在GM-CSF 及IL-4 作用下誘導(dǎo)生成imDC，繼而在M-CSF 與RANKL 作用下轉(zhuǎn)分化為OC。本實(shí)驗(yàn)過程中，以TRAP 染色及骨吸收作用鑒定生成的OC 活性，結(jié)果證實(shí)imDC 在M-CSF與RANKL 作用下可轉(zhuǎn)分化為TRAP 染色陽性的多核OC，并具有骨吸收作用，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果亦顯示誘導(dǎo)生成的細(xì)胞表達(dá)OC 特異性表面抗原物質(zhì)CD51/61。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體外條件下，imDC 可轉(zhuǎn)分化為具有骨吸收作用的多核OC。因此推測，imDC可能是MM 患者OC 重要來源，參與促進(jìn)MM 患者M(jìn)BD 的發(fā)生，如何阻斷這一途徑在防治MBD 方面有重要意義。

二膦酸鹽可抑制OC 相關(guān)性溶骨性改變，臨床研究證實(shí)Zol 及帕米膦酸鹽等二膦酸鹽的應(yīng)用可明顯減少骨骼相關(guān)性事件的發(fā)生，是目前MBD 標(biāo)準(zhǔn)治療的主要藥物［10，11］。新近的研究發(fā)現(xiàn)二膦酸鹽有更廣泛的作用，如Zol 和帕米膦酸鹽可誘導(dǎo)MM 瘤細(xì)胞凋亡，在骨髓微環(huán)境下抑制MM 瘤細(xì)胞生長并通過免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)揮抗腫瘤作用［12］。同時，在體外條件下，Zol 可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，可能在MM 患者骨破壞成骨細(xì)胞活性恢復(fù)方面發(fā)揮作用［13］。此外，Zol 還能在體內(nèi)外激活γδ T 細(xì)胞，后者是否參與MBD 的發(fā)生是本文作者關(guān)注的方向。

γδ T 細(xì)胞為一類表達(dá)γδ TCR 的特殊免疫T 淋巴細(xì)胞，具有抗原特異性識別而無MHC 限制性，不僅具有固有免疫作用、發(fā)揮抗原提呈細(xì)胞的功能并可執(zhí)行適應(yīng)性免疫功能，已被證實(shí)可在體內(nèi)外抑制多種腫瘤的生長，是目前腫瘤細(xì)胞免疫治療的新熱點(diǎn)［14］。Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞為細(xì)胞表面表達(dá)γδ TCR 的一類特殊T 細(xì)胞亞群，是γδ T 細(xì)胞的主要亞群。Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞識別非多肽抗原、天然磷酸抗原或者甲羥戊酸(MVA)代謝途徑中間產(chǎn)物異戊烯焦磷酸抗原(IPP)可大量激活擴(kuò)增Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞，在體內(nèi)外發(fā)揮抗腫瘤作用。

國內(nèi)外研究證實(shí)，外周血來源、骨髓來源或臍血來源的單個核細(xì)胞在體外條件下可擴(kuò)增獲得較高純度的Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞［15］。由于外周血來源較為簡便，更易獲得，據(jù)報道，體外條件下，γδ T 細(xì)胞經(jīng)刺激后可擴(kuò)增100 倍，足以應(yīng)用于MM 患者臨床免疫治療。本實(shí)驗(yàn)采用Zol 與重組人IL-2 體外激活擴(kuò)增PBMNC 中的γδ T 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Zol 和IL-2聯(lián)合作用可選擇性擴(kuò)增外周血來源PBMNC 中的γδ T 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中，所選擇的3 例MM 患者治療上均未達(dá)緩解，在入院化療前尚未使用Zol，在體外培養(yǎng)條件下，外周血中的γδ T 細(xì)胞可經(jīng)Zol 和IL-2 激活擴(kuò)增，并獲得較高純度，且與健康志愿者相比較二者擴(kuò)增后獲得的純度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，本文的結(jié)果與Burjanadzé 等［16］報告大致相仿。

新近研究發(fā)現(xiàn)，Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞不僅可抑制OC活性，還可抑制其產(chǎn)生，破壞MM-OC 惡性循環(huán)過程，從而阻止MM 進(jìn)展，在一定程度上降低MBD 事件。Cui 等［17］報道，經(jīng)Zol 及IL-2 體外激活擴(kuò)增的Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞對MM 骨髓微環(huán)境下的OC 有殺傷作用。實(shí)驗(yàn)過程中，擴(kuò)增后的Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞與同一志愿者PBMNC 誘導(dǎo)生成的貼壁生長OC 按照不同的效靶比共培養(yǎng)12 h 后，貼壁生長的OC 可發(fā)生溶解，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

本研究中采用millicell 共培養(yǎng)技術(shù)，建立γδ T細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)體系，研究在體外條件下γδ T 細(xì)胞對其下室中imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 過程的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Zol 和IL-2 聯(lián)合刺激擴(kuò)增的γδ T 細(xì)胞及IL-2 單獨(dú)刺激擴(kuò)增的γδ T 細(xì)胞均可抑制imDC 轉(zhuǎn)分化為OC，前者更甚。

我們認(rèn)為在γδ T 細(xì)胞存在的條件下，imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 過程受到限制。至于γδ T 細(xì)胞如何影響imDC 轉(zhuǎn)分化為OC，目前還不清楚。有報道激活的γδ T 細(xì)胞可分泌TNF-α 和IFN-γ，促進(jìn)imDC 成熟［18］，我們推測可能在共培養(yǎng)過程γδ T 細(xì)胞促進(jìn)imDC 成熟而減少其向OC 轉(zhuǎn)分化。

TNF-α 主要有巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎及骨關(guān)節(jié)炎等多種風(fēng)濕性疾病活動［19-21］，相關(guān)研究認(rèn)為其可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟，參與骨破壞過程［22］。本實(shí)驗(yàn)過程中γδ T 細(xì)胞-imDC 間接接觸共培養(yǎng)組較γδ T 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組分泌的TNF-α 水平高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在共培養(yǎng)過程中imDC 可能增加γδ T 細(xì)胞TNF-α的分泌;共培養(yǎng)組較imDC 單獨(dú)培養(yǎng)組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，在imDC 轉(zhuǎn)分化過程中是否可能增加細(xì)胞TNF-α 的分泌需進(jìn)一步求證。綜上所述，體外激活的γδ T 細(xì)胞可抑制imDC 轉(zhuǎn)分化為OC，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)觀察了激活的γδ T 細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下對imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 的影響。研究發(fā)現(xiàn):(1)MM 患者和健康志愿者來源的PBMNC 在Zol 和IL-2 作用下，選擇性擴(kuò)增γδ T 細(xì)胞;(2)imDC 在RANKL 和M-CSF 存在條件下可轉(zhuǎn)分化為具有骨吸收作用的OC;(3)在γδ T 細(xì)胞存在的條件下，imDC轉(zhuǎn)分化為OC 過程受限。綜上所述，γδ T 細(xì)胞具有抑制imDC 轉(zhuǎn)分化為OC 的作用，有望成為MBD 治療的新手段，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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