陳永強 鄭 璐 劉軍權(quán) 呂小婷 周 燏 陳 玲 徐 晶 周忠海 陳復(fù)興

(解放軍第97 醫(yī)院中心實驗室，徐州 221004)

4，6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)是糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制劑，目前研究發(fā)現(xiàn)TWS119 通過激活Wnt/β-catenin信號通路阻滯CD8+T 淋巴細(xì)胞的分化獲得表達CD45RA+CD62L+CCR7+CD95+的干細(xì)胞樣記憶細(xì)胞(Stem cells memory T cells，TSCM)和CD45RA+CD62L+的早期分化細(xì)胞，這群細(xì)胞在體內(nèi)具有強增殖能力和抗腫瘤活性［1-3］。γδT 細(xì)胞是T 淋巴細(xì)胞中表達γδTCR 的一個亞群，約占外周血T 淋巴細(xì)胞的0.5%～5%，在機體的抗感染、抗腫瘤和免疫監(jiān)視等方面起到重要作用［4］。體外常規(guī)擴增的γδT細(xì)胞已經(jīng)用于多種腫瘤的治療，并取得較好的療效［5］。為了提高γδT 細(xì)胞治療效果，我們認(rèn)為使回輸?shù)襟w內(nèi)的γδT 細(xì)胞能在體內(nèi)較長時間的生存并能遷移到腫瘤部位，從而發(fā)揮有效的免疫監(jiān)視和殺傷腫瘤的作用至關(guān)重要。因此，本研究觀察TWS119 調(diào)控Wnt/β-Catenin 信號通路對γδT 細(xì)胞增殖和表型的影響，以期獲得新型的γδT 細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料 TWS119 購自Sigma 公司，用二甲亞砜(DMSO)溶解配制母液為8 mmol/L，實驗時再用RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋至各實驗濃度(各實驗組DMSO 終體積分?jǐn)?shù)≤0.1%)，對照組中加入相同濃度的DMSO;RPMI1640 和小牛血清購自Gibco 公司;人淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)，異戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)購自廈門特寶生物工程股份有限公司;熒光抗體PerCPcy5.5-γδTCR、FITC-CD45RA 和PE-CD62L 和 流 式細(xì)胞儀均為美國Becton Dickson 公司產(chǎn)品;CCK-8試劑盒、BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、Western 及IP 細(xì)胞裂解液和PVDF 膜均購自碧云天生物技術(shù)研究所;人AB 型血清購自徐州市血站。

1.2 方法

1.2.1 γδT 細(xì)胞的培養(yǎng) 取健康獻血者外周抗凝血20 ml，加入淋巴細(xì)胞分離液，1 800 r/min 離心10 min，吸取人末梢血單個核細(xì)胞(PBMCs)層，用生理鹽水洗滌，1 800 r/min 離心15 min。然后將PBMCs加入含10%小牛血清、5% AB 血清、1 μg/ml 的異戊烯焦磷酸和200 U/ml 的rhIL-2 的γδT 培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況及時添加培養(yǎng)基。

1.2.2 γδT 細(xì)胞鑒定 將培養(yǎng)10 d 的γδT 細(xì)胞在倒置顯微鏡下進行形態(tài)觀察，并用PerCP-cy5.5-γδTCR 抗體標(biāo)記細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進行表型檢測，試驗重復(fù)3 次。

1.2.3 TWS119 活化Wnt/β-catenin 信號通路中βcatenin 表達影響 取培養(yǎng)10 d 的γδT 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1 ×105ml-1的細(xì)胞懸液，接種于6 孔板，每孔3 ml，然后加入終濃度分別為(0.0、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L)的TWS119，于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞并用PBS 洗滌1 次后，用Western blot 及IP 細(xì)胞裂解液60 μl 充分裂解提取蛋白，BCA 法測樣品蛋白濃度后以10% SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，兔抗人β-catenin 和鼠抗人GAPDH 一抗(1∶500)4℃封閉過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記抗鼠二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。然后利用碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，按照操作手冊進行顯色。然后用數(shù)碼相機進行拍照記錄。試驗重復(fù)3 次。

1.2.4 CCK-8 法檢測TWS119 對γδT 細(xì)胞增殖的影響 取培養(yǎng)10 d 的γδT 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1.0 ×105ml，取180 μl 接種于96 孔板，加入終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L TWS119，每組設(shè)4 個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μl 的CCK-8 液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后于570 nm 處測定光密度值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測γδT 細(xì)胞上CD45RA 和CD62L 的表達 將培養(yǎng)成功的γδT 細(xì)胞配成濃度為1.0 ×105ml 的細(xì)胞懸液，接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔3 ml，然后加入終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 的TWS119。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并用PBS 洗滌2 次，每管分 別 加 入10 μl 的PerCP-cy5.5-γδTCR、FITCCD45RA 和PE-CD62L，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml 的PBS 溶液中，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD45RA 和CD62L 的表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以±s 表示，組間均值比較采用t 檢驗，P＜0.05，P＜0.01 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 γδT 細(xì)胞鑒定 從健康獻血者外周血中分離獲得單個核細(xì)胞后用γδT 細(xì)胞的培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d 后γδT 細(xì)胞開始增殖，4 d 后呈集落式生長，到第8 天后出現(xiàn)許多大小不同的細(xì)胞集落，細(xì)胞成梭形(圖1A)。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型，結(jié)果如圖1B 顯示，γδT 細(xì)胞比率達(76.85 ±4.85)%。以上結(jié)果提示γδT 細(xì)胞培養(yǎng)成功，可為后續(xù)實驗使用。

圖1 γδT 細(xì)胞的鑒定Fig.1 Proportion of γδT cells

2.2 TWS119 對γδT 細(xì)胞中β-catenin 蛋白表達影響 Wnt 信號通路在細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵作用，該通路可以被TWS119 通過抑制GSK-3β 活性使βcatenin 在細(xì)胞內(nèi)積聚而激活。將不同濃度TWS119培養(yǎng)的γδT 細(xì)胞經(jīng)Western blot 檢測結(jié)果顯示，隨著TWS119 濃度增加，γδT 細(xì)胞內(nèi)β-catenin 表達量逐漸增多，呈劑量依賴性，說明TWS119 可以激活γδT細(xì)胞中的Wnt/β-catenin 信號通路(圖2)。

2.3 TWS119 對培養(yǎng)γδT 細(xì)胞純度的影響 在γδT細(xì)胞培養(yǎng)過程中，分別于第1 天和第8 天時，加入不同濃度的TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)到12 d 時經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)組中，濃度在0.5～2.0 μmol/L 時對γδT 細(xì)胞純度影響不明顯，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05);濃度在4.0 和8.0 μmol/L 時，與對照組相比能顯著抑制γδT 細(xì)胞純度(P＜0.05，P＜0.01)。而在第8 天加入TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)組中，在0.5～8.0 μmol/L 范圍內(nèi)能顯著提高γδT 細(xì)胞純度(P＜0.05，P＜0.01)。見圖3。

2.4 TWS119 對γδT 細(xì)胞增殖影響 第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)組中，經(jīng)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 的TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d 后，CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，TWS119 濃度在2.0 μmol/L 時能促進γδT細(xì)胞的增殖(P＜0.05);當(dāng)濃度(＞2.0 μmol/L)時，顯著抑制γδT 細(xì)胞的增殖(P＜0.05，P＜0.01)。而在第8 天加入TWS119 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)到12 d 后，各濃度組增殖率分別為:(29.35 ±5.95)%、(40.53 ±4.12)%、(81.38 ± 6.33)%、(70.37 ± 5.85)%、(-11.29 ±3.86)%。與0 μmol/L TWS119 對照組相比，0.5～4.0 μmol/L 組增殖率顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，2.0 μmol/L TWS119 處理的γδT 細(xì)胞增殖率達到最高值(81.38±6.33)%;當(dāng)濃度增高到8.0 μmol/L 時，增殖率低于對照組(圖4)。

圖2 TWS119 對γδT 細(xì)胞中β-catenin 蛋白表達影響Fig.2 Western blot analysis of β-catenin expression in γδT cells

圖3 TWS119 對培養(yǎng)γδT 細(xì)胞純度的影響Fig.3 Ratios of induced γδT cells under different concentrations of TWS119

圖4 TWS119 對γδT 細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of treatment of TWS119 on γδT cell proliferative response

表1 TWS119 對γδT 細(xì)胞CD45RA 和CD62L 表達的影響Tab.1 Effect of TWS119 on expression of CD45RA and CD62L in γδT cells

圖5 TWS119 對γδT 細(xì)胞CD45RA 和CD62L 表達的影響Fig.5 Effect of TWS119 on expression of CD45RA and CD62L in γδT cells

2.5 TWS119 對γδT 細(xì)胞表型的影響 經(jīng)不同時間加入不同TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)到12 d 后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，不同加入時間和不同劑量對CD62L 和CD45RA 的表達有影響。如表1 和圖5 所示，濃度在0～8.0 μmol/L 范圍內(nèi)TWS119 能促進γδT 細(xì)胞表面標(biāo)志CD62L 的表達，且第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)組CD62L 的表達要高于第8 天加入組。TWS119 對γδT 細(xì)胞表面標(biāo)志CD45RA 表達的影響結(jié)果中顯示，僅在第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)組中4.0 μmol/L 和8.0 μmol/L 濃度組能顯著提高CD45RA 的表達，而在第8 天時再加入TWS119 對CD45RA 的表達變化不明顯。

3 討論

Wnt/β-catenin 信號通路是一條在生物進化中極為保守的通路，在調(diào)控干細(xì)胞的自我更新、多潛能性和不同發(fā)育階段胸腺細(xì)胞的生長中起關(guān)鍵作用［6，7］。最近研究人員為了在體外獲得最佳分化狀態(tài)的免疫細(xì)胞應(yīng)用以腫瘤過繼性免疫治療，發(fā)現(xiàn)用GSK-3β 抑制劑TWS119 活化T 淋巴細(xì)胞的Wnt/βcatenin 信號通路可以阻滯初始T 細(xì)胞向效應(yīng)T 細(xì)胞分化，獲得CD45RA+CD62L+早期分化的細(xì)胞和TSCM［2，8，9］。而且TSCM 細(xì)胞具備干細(xì)胞的特性，具有很強的增殖和分化能力，體內(nèi)腫瘤移植實驗表明其體內(nèi)有很強的抑瘤活性，與其他效應(yīng)細(xì)胞相比在體內(nèi)生存期明顯延長［10，11］;用CD3/CD2/CD28 特異性抗體激活后與IL-7、IL-15 共培養(yǎng)，TSCM 細(xì)胞也能有效的擴增［12］。因此，我們在培養(yǎng)γδT 細(xì)胞時加入TWS119 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，首先觀察誘導(dǎo)前后γδT細(xì)胞的增殖和純度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)γδT 細(xì)胞的第1 天加入TWS119 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)到12 d 時，濃度在0.5～2.0 μmol/L 時對γδT 細(xì)胞的增殖和純度影響不明顯，當(dāng)濃度大于2 μmol/L 時能顯著抑制γδT 細(xì)胞的增殖和純度;而在第8 天加入TWS119誘導(dǎo)培養(yǎng)到12 d 時，在0.5～4.0 μmol/L 范圍內(nèi)能顯著促進γδT 細(xì)胞的增殖并能提高γδT 細(xì)胞的純度，當(dāng)濃度大于8.0 μmol/L 時γδT 細(xì)胞增殖率和純度降低。TWS119 加入誘導(dǎo)時間的不同對增殖和純度的影響可能跟細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān)。

根據(jù)T 細(xì)胞的表型和效應(yīng)功能可以分為初始T細(xì)胞、干細(xì)胞樣中樞記憶T 細(xì)胞、中樞記憶T 細(xì)胞、效應(yīng)記憶T 細(xì)胞和效應(yīng)T 細(xì)胞［13，14］。CD45RA 表達于初始細(xì)胞和記憶性干細(xì)胞，而L-選擇素(CD62L)屬于黏附分子超家族，廣泛分布于初始T細(xì)胞記憶性干細(xì)胞和中樞型記憶T 淋巴細(xì)胞表面，是淋巴細(xì)胞的特異性歸巢受體，在介導(dǎo)初始淋巴細(xì)胞歸巢到外周淋巴結(jié)和淋巴細(xì)胞在炎癥和腫瘤部位中起著至關(guān)重要的作用［15］。TWS119 對γδT 細(xì)胞表型影響研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同時間加入不同濃度的TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT 細(xì)胞到12 d 后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，濃度在0～8.0 μmol/L 范圍內(nèi)，僅第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)組中4.0 μmol/L 和8.0 μmol/L 濃度組能顯著提高CD45RA 的表達。而對CD62L 表達方面，TWS119 能促進γδT 細(xì)胞表面標(biāo)志CD62L 的表達，且第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)組CD62L 的表達要高于第8 天加入組。提示用TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT 細(xì)胞可以阻滯或誘導(dǎo)CD45RA+和CD62L+的表達，從而獲得CD45RA+CD62L+γδT 細(xì)胞和CD62L+γδT 細(xì)胞。

本研究結(jié)論是TWS119 可以活化γδT 細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號通路，在一定濃度范圍內(nèi)能促進γδT 細(xì)胞增殖和提高γδT 細(xì)胞純度，同時能劑量依賴性調(diào)控CD45RA 和CD62L 的表達獲得CD45RA+CD62L+γδT 細(xì)胞和CD62L+γδT 細(xì)胞。我們研究結(jié)果為進一步提高γδT 細(xì)胞治療腫瘤提供了實驗依據(jù)。但有關(guān)該群細(xì)胞具體的生物學(xué)特性、體內(nèi)抗腫瘤療效以及今后的于臨床腫瘤試治等有待進一步研究。

［1］Ding S，Wu TY，Brinker A，et al.Synthetic small molecules that control stem cell fate［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(13):7632-7637.

［2］Gattinoni L，Lugli E，Ji Y，et al.A human memory T cell subset with stem cell-like properties［J］.Nat Med，2011，17 (10):1290-1297.

［3］Muralidharan S，Hanley PJ，Liu E，et al.Activation of Wnt signaling arrests effector differentiation in human peripheral and cord blood-derived T lymphocytes［J］.J Immunol，2011，187(10):5221-5232.

［4］Vantourout P，Hayday A.Six-of-the-best:unique contributions of γδ T cells to immunology［J］.Nat Rev Immunol，2013，13(2):88-100.

［5］Hannani D，Ma Y，Yamazaki T，et al.Harnessing γδ T cells in anticancer immunotherapy［J］.Trends Immunol，2012，33 (5):199-206.

［6］Serio RN.Wnt of the two horizons:putting stem cell self-renewal and cell fate determination into context［J］.Stem Cells Dev，2014，23(17):1975-1990.

［7］Kvell K，F(xiàn)ejes AV，Parnell SM，et al.Active Wnt/beta-catenin signaling is required for embryonic thymic epithelial development and functionality ex vivo［J］.Immunobiology，2014，219(8):644-652.

［8］Forget MA，Huon Y，Reuben A，et al.Stimulation of Wnt/β-catenin pathway in human CD8+T lymphocytes from blood and lung tumors leads to a shared young/memory phenotype［J］.PLoS One，2012，7(7):e41074.

［9］Muralidharan S，Hanley PJ，Liu E，et al.Activation of Wnt signaling arrests effector differentiation in human peripheral and cord blood-derived T lymphocytes［J］.J Immunol，2011，187(10):5221-5232.

［10］Gattinoni L，Klebanoff CA，Palmer DC，et al.Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+T cells［J］.J Clin Invest，2005，115(6):1616-1626.

［11］Hinrichs CS，Borman ZA，Cassard L，et al.Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+T cells mediate superior antitumor immunity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(41):17469-17474.

［12］Lugli E，Gattinoni L，Roberto A，et al.Identification，isolation and in vitro expansion of human and nonhuman primate T stem cell memory cells［J］.Nat Protoc，2013，8(1):33-42.

［13］Farber DL，Yudanin NA，Restifo NP.Human memory T cells:generation，compartmentalization and homeostasis［J］.Nat Rev Immunol，2014，14(1):24-35.

［14］Dieli F，Poccia F，Lipp M，et al.Differentiation of effector/memory Vdelta2 T cells and migratory routes in lymph nodes or inflammatory sites［J］.J Exp Med，2003，198(3):391-397.

［15］Brinkman CC，Peske JD，Engelhard VH.Peripheral tissue homing receptor control of naive，effector，and memory CD8 T cell localization in lymphoid and non-lymphoid tissues［J］.Front Immunol，2013，4:241.