王建軍 王澤友 姚永良 吳建紅 李光新 (江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院 檢驗(yàn)科，昆山 215300)

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性活動(dòng)性胃炎、胃潰瘍以及胃癌的主要病因，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究會(huì)將幽門(mén)螺桿菌定為Ⅰ級(jí)或明確的人類致癌因子［1］。據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部門(mén)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)幽門(mén)螺桿菌感染率高達(dá)到53%以上，感染者超過(guò)6 億，同時(shí)流行病學(xué)調(diào)查表明胃癌發(fā)生率與幽門(mén)螺桿菌的感染率呈正相關(guān)。

幽門(mén)螺桿菌感染入侵機(jī)體后促進(jìn)胃黏膜中巨噬細(xì)胞大量增殖，增強(qiáng)胃黏膜局部炎癥因子如白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、IL-8、IL-18 的表達(dá)，引起胃黏膜局部強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，并在這些細(xì)胞因子的募集下誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移并浸潤(rùn)到胃黏膜局部組織從而清除幽門(mén)螺桿菌［2，3］。巨噬細(xì)胞是胃黏膜中防御幽門(mén)螺桿菌的重要免疫細(xì)胞，它主要通過(guò)分泌腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1、IL-10、IL-12 等多種細(xì)胞因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并與活性氧、活性氮等共同作用清除幽門(mén)螺桿菌［4，5］。本文主要通過(guò)幽門(mén)螺桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞的感染來(lái)研究巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及其對(duì)宿主細(xì)胞的凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人THP-1 細(xì)胞系、幽門(mén)螺桿菌菌株購(gòu)自中科院上海生科院細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自HyClone 生物技術(shù)公司。IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司;Annexin-V FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海前塵生物技術(shù)公司;預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)marker、Cocktail 蛋白酶抑制劑及蛋白質(zhì)提取試劑盒均購(gòu)自Fermantas 生物技術(shù)公司。兔抗人COX2、NOS2 抗體、鼠抗人GAPDH 抗體、羊抗兔IgG 及羊抗鼠IgG 抗體均購(gòu)自上海義森生物科技有限公司。佛波酯(12-鄰-14-烷酰佛波醇-13-乙酸酯，Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)及DMSO 購(gòu)自德國(guó)默克生物技術(shù)公司。

1.2 幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng) 幽門(mén)螺桿菌菌株接種于以布氏瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的，含6%脫纖維新鮮羊血及聯(lián)合抗生素(三甲氧芐氨嘧啶5 mg/L、萬(wàn)古霉素6 mg/L、兩性霉素2 mg/L)的血平板上，于10%CO2，5%O2及85%N2混合氣體培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72 h。細(xì)胞刮輕輕刮下幽門(mén)螺桿菌后以無(wú)菌生理鹽水震蕩1 min，稀釋使其濁度與麥?zhǔn)?.5 號(hào)管濁度一致(即菌液濃度約為1.5 ×108個(gè)/ml)，計(jì)算得出原菌液濃度(1.5 ×109ml-1)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞于含10 %胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)48 h 后，0.1 mmol/L PMA 誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞24 h，使其分化形成巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為三組即空白對(duì)照組、LPS 刺激組(50 ng/ml)、幽門(mén)螺桿菌處理組(細(xì)菌∶細(xì)胞=10∶1)。

1.4 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子 巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS，幽門(mén)螺桿菌處理24 h 后，4℃，1 000 r/min 離心5 min，收集各處理組的細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA 試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 的含量(按照試劑盒說(shuō)明操作)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算待測(cè)樣品中IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 的濃度。

1.5 Western blot 蛋白質(zhì)提取試劑盒提取LPS，幽門(mén)螺桿菌處理的巨噬細(xì)胞總蛋白，Bradford 法測(cè)定總蛋白濃度。配制10%SDS-PGAE 電泳膠，將變性后的蛋白質(zhì)按50 μg 的蛋白總量進(jìn)行垂直電泳，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，兔抗人COX2 抗體、兔抗人NOS2 抗體、鼠抗人GAPDH 抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后將PVDF 膜于凝膠成像儀中曝光顯影。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 收集LPS、幽門(mén)螺桿菌刺激后的巨噬細(xì)胞106個(gè)，PBS(含2 g/L BSA)輕輕洗滌2 次;然后分別加入10 μl 的FITC 標(biāo)記的Annexin-V 抗體及PE 試劑，重懸細(xì)胞后室溫避光孵育30 min。PBS(含2 g/L BSA)洗滌細(xì)胞2 次，0.4 ml PBS(含2 g/L BSA)重懸細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行處理分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用Scheffe 法，P＜ 0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞炎癥因子分析 ELISA 方法檢測(cè)LPS、幽門(mén)螺桿菌刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞上清中IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 的含量，獨(dú)立重復(fù)八次實(shí)驗(yàn)，Graph-Pad Prism 5 軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明幽門(mén)螺桿菌處理巨噬細(xì)胞后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-23、IL-10、TNF-α、IL-8 細(xì)胞因子顯著增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖1)。

圖1 ELISA 方法檢測(cè)LPS、Hp 刺激巨噬細(xì)胞后細(xì)胞上清中細(xì)胞因子含量變化(n=8)Fig.1 Cytokines in cell supernatant of macrophages stimulated with LPS or Hp for 24 h were detected by ELISA method(n=8)

圖2 Western blot 分析LPS、Hp 處理巨噬細(xì)胞后細(xì)胞中NOS2 與COX2 的表達(dá)水平(n=3)Fig.2 Expression of NOS2 and COX2 in macrophages treated with LPS or Hp was analyzed by Western blot(n=3)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS、Hp 處理巨噬細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡變化(n=3)Fig.3 Apoptosis of macrophages treated with LPS，Hp or medium was detected by flow cytometry(n=3)

2.2 Western blot 分析NOS2 與COX2 蛋白表達(dá) 幽門(mén)螺桿菌、LPS 及空白對(duì)照物Medium 分別處理巨噬細(xì)胞24 h 后，Western blot 分析細(xì)胞炎癥關(guān)鍵酶COX2 及NOS2 的表達(dá)水平(圖2)，Image J 掃描其灰度并經(jīng)GAPDH 灰度值校正后，GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)表明LPS 刺激巨噬細(xì)胞后NOS2、COX2 表達(dá)上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而幽門(mén)螺桿菌處理巨噬細(xì)胞后，NOS2、COX2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞經(jīng)幽門(mén)螺桿菌處理后的細(xì)胞凋亡 LPS、幽門(mén)螺桿菌及空白對(duì)照物Medium 分別刺激巨噬細(xì)胞24 h 后，收集各處理組巨噬細(xì)胞并以FITC 標(biāo)記的Annexin-V 抗體、PE 試劑孵育后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞凋亡情況(圖3)，GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)分析各組數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明幽門(mén)螺桿菌作用巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.03)。

3 討論

幽門(mén)螺桿菌感染機(jī)體后，機(jī)體固有免疫是抵御幽門(mén)螺桿菌感染的天然屏障，胃組織中的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞通過(guò)分泌IL-1、IL-12、IL-18 等細(xì)胞因子，激活免疫細(xì)胞并分泌炎癥介質(zhì)，發(fā)揮抗感染作用。胃組織中的巨噬細(xì)胞被幽門(mén)螺桿菌感染后，巨噬細(xì)胞在炎癥組織局部浸潤(rùn)、增生、激活并分泌TNF-α、IL-1、IL-8 等細(xì)胞因子，活化淋巴細(xì)胞及殺傷入侵微生物。同時(shí)TNF-α 協(xié)同誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，誘導(dǎo)DNA 的損傷導(dǎo)致宿主細(xì)胞的凋亡［6］。細(xì)胞因子IL-8、IL-10、IL-23 等具有顯著的細(xì)胞趨化作用，并能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞變形、脫顆粒和溶酶體釋放反應(yīng)，釋放出的蛋白酶能直接損害細(xì)胞，參與局部炎癥反應(yīng)。白細(xì)胞介素在幽門(mén)螺桿菌感染相關(guān)性疾病的局部炎癥及胃黏膜損傷中起重要作用，其表達(dá)水平與幽門(mén)螺桿菌導(dǎo)致的胃炎活動(dòng)度、炎癥程度及幽門(mén)螺桿菌密度均顯著相關(guān)。本研究體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌作用巨噬細(xì)胞后能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子IL-10、IL-23、TNF-α 及IL-8 的分泌，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)幽門(mén)螺桿菌的殺傷作用。

一氧化氮合酶-2(Nitric oxide synthase-2，NOS2)可促進(jìn)環(huán)氧酶-2(Cyclooxygenase-2，COX2)的激活，同時(shí)細(xì)胞炎癥反應(yīng)促進(jìn)NOS2 和COX2 表達(dá)水平增強(qiáng)從而協(xié)同促進(jìn)人結(jié)腸癌的發(fā)生［7］。幽門(mén)螺桿菌感染胃組織細(xì)胞后通過(guò)炎癥細(xì)胞釋放細(xì)胞因子間接誘導(dǎo)胃黏膜炎癥細(xì)胞表達(dá)COX2，再通過(guò)旁分泌機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起上皮細(xì)胞表達(dá)COX2［8］。此外，幽門(mén)螺桿菌感染及其毒素可能直接誘導(dǎo)COX2 表達(dá)，并通過(guò)啟動(dòng)ERKI/ERK2 磷酸化等級(jí)聯(lián)事件引起NF-κB 的激活、促進(jìn)COX2 和NOS2 表達(dá)增加［9］。本研究Western blot 結(jié)果表明，幽門(mén)螺桿菌作用巨噬細(xì)胞后感染促進(jìn)細(xì)胞COX2 與NOS2 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞呼吸爆炸反應(yīng)對(duì)幽門(mén)螺桿菌的侵襲做出免疫反應(yīng)。

幽門(mén)螺桿菌感染巨噬細(xì)胞后在巨噬細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生自噬小體(Autophagosome)，逃避巨噬細(xì)胞對(duì)其殺傷，并且幽門(mén)螺桿菌能在巨噬細(xì)胞自噬小體內(nèi)持續(xù)增殖，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的凋亡并感染周圍巨噬細(xì)胞加重感染［10］，而我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，幽門(mén)螺桿菌長(zhǎng)時(shí)間作用巨噬細(xì)胞可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的大量凋亡。本文主要分別從炎性因子分泌、炎癥反應(yīng)關(guān)鍵酶表達(dá)等方面初步研究幽門(mén)螺桿菌感染巨噬細(xì)胞后引起的炎癥反應(yīng)，但具體的炎癥機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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