胡雪菲 江文正 (華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海 200241)

顆粒酶A(Granzyme A，GzmA)是一種存在于細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)及自然殺傷細(xì)胞(Natural killer，NK)中的絲氨酸蛋白酶［1］。GzmA 主要誘導(dǎo)一種caspases 非依賴性的細(xì)胞凋亡，它通過顆粒的胞吐作用釋放，在穿孔素(Perforin)協(xié)同作用下進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞漿中，并聚集在細(xì)胞核［2-4］，通過裂解SET 復(fù)合物釋放的脫氧核糖核酸酶NM23-H1 對染色體DNA 形成單股DNA鏈切(缺)口而引起DNA 斷裂，最終引起靶細(xì)胞的凋亡［5］。近來的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在一些健康捐助者的血清中檢測到了顆粒酶A 的存在，而當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，在血清和其他體液中可檢測到更高水平的顆粒酶A［6］，說明顆粒酶A 除了具有細(xì)胞毒性功能外，還可能在細(xì)胞外發(fā)揮促進(jìn)炎癥和降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能，從而允許細(xì)胞毒性細(xì)胞接近組織內(nèi)的靶細(xì)胞，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究以含GzmA全長基因的質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增aGzmA 基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)和表達(dá)條件的優(yōu)化，以期獲得有活性的人顆粒酶A 重組蛋白，為進(jìn)一步研究其功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株 含全長人GzmA 基因的重組質(zhì)粒pET24a-GzmA 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［7］。原核表達(dá)載體pET24a(+)、E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA 連接酶和PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司;IPTG和DNA 膠回收試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)公司;DNA marker、蛋白質(zhì)marker 和小鼠抗His 單克隆抗體購自天根生化科技(北京)有限公司;HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 二抗購自Sigma 公司;ECL Western Blotting Substrate Kit 購自Thermo Scientific 公司。N-alpha-benzyloxycarbonyl-L-lysine thiobenzyl ester (BLT)為CALBIOCHEM 公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中GzmA 全長序列(CR456968.1)設(shè)計(jì)人活性顆粒酶A 上下游引物，并引入相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，上游引物序列為:5'-GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3'(下劃線部分為NedⅠ酶切位點(diǎn)，85-103);下游引物序列為:5'-CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3'(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)，769-786)，擴(kuò)增片段大小約為700 bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4 人aGzmA 基因的擴(kuò)增 以含全長人GzmA 基因的質(zhì)粒pET24a-GzmA 為模板擴(kuò)增aGzmA 基因，PCR 反應(yīng)條件為94℃2 min;94℃45 s，58℃30 s，72℃1 min，共35 個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳分析并回收。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR 產(chǎn)物用NdeⅠ和XhoⅠ于37℃雙酶切3～8 h，回收酶切產(chǎn)物，與經(jīng)同樣酶切處理的載體質(zhì)粒pET24a(+)在T4 DNA連接酶作用下16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)菌后，涂平板培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定。挑選陽性重組子送上海生物工程有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pET24a-aGzmA。

1.6 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE 分析 將測序正確的重組質(zhì)粒pET24a-aGzmA 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，挑取單菌落接種至含100 μg/ml 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min 搖床搖菌過夜，次日按1%轉(zhuǎn)接至含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，至OD600達(dá)0.4～1.0 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。離心搜集菌體，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min 后上樣進(jìn)行SDS-PAGE 分析。以未誘導(dǎo)的重組菌、誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)化菌BL21/pET24a(+)和誘導(dǎo)的空白菌BL21 作為對照。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 鑒定 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至NC 膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST 常溫封閉1～2 h;加入小鼠抗His 單克隆抗體(1∶2 000 稀釋)，4℃孵育過夜;再加入HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(用5%脫脂奶粉1∶5 000 稀釋)，常溫作用1 h;洗滌后，用ECL Western blot Substrate Kit 顯影。以未誘導(dǎo)的重組菌、誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)化菌BL21/pET24a(+)和誘導(dǎo)的空白菌BL21作為對照。

1.8 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 對誘導(dǎo)溫度(37℃、30℃、25℃)、IPTG 濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mmol/L)、誘導(dǎo)時(shí)間(2、4、6、8、10 h)和開始誘導(dǎo)時(shí)菌液濃度(OD600=0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、2.0)進(jìn)行優(yōu)化，改變待優(yōu)化的條件時(shí)，其他條件固定。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 電泳后利用軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 重組蛋白的純化 收集100 ml 經(jīng)IPTG 于37℃誘導(dǎo)4 h 的BL21/pET24a-aGzmA 菌液，離心收集菌體，用PBS 重懸，然后置于超聲波破碎儀中進(jìn)行超聲破碎;破碎后，于4℃，12 000 r/min，離心15 min，收集的沉淀，用含8 mol/L 尿素的binding buffer溶液重懸，使包涵體中的蛋白溶解在尿素溶液中，離心收集獲得的上清，0.45 μm 濾膜過濾。將過濾后的溶液通過預(yù)處理好的鎳柱進(jìn)行親和層析純化，然后用binding buffer 和washing buffer 洗去未結(jié)合的雜質(zhì)，最后用含高濃度咪唑的elute buffer 使親和力減弱，從而將人活性顆粒酶A 重組蛋白洗脫下來。洗脫液經(jīng)透析后超濾濃縮，該濃縮液中即含有重組人活性顆粒酶A 蛋白。

1.10 重組蛋白的活性檢測 按文獻(xiàn)［8］介紹的方法進(jìn)行。即將500 μl 20 mmol/L BLT 貯存液、500 μl 20 mmol/L DTNB 貯存液、500 μl Triton X-100 和48.5 ml PBS 混合制備BLT 底物溶液。在96 孔板每孔中加入200 μl 底物溶液，再加入20 μl 目的蛋白，并設(shè)置PBS、透析液作為空白對照和陰性對照，37℃放置20 min，用酶標(biāo)儀測定其在412 nm 處的紫外光吸光度。

2 結(jié)果

2.1 人aGzmA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 人aGzmA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約700 bp 的特異DNA 片段，大小與預(yù)期相符，其電泳結(jié)果見圖1。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 將aGzmA 基因和載體質(zhì)粒pET24a(+)的雙酶切產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化后，從平板上挑選生長良好的菌落，抽提質(zhì)粒并用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，其酶切圖譜見圖2。從圖2可以看出，陽性重組質(zhì)粒酶切后呈現(xiàn)兩條帶，包含約700 bp 目的基因片段，表明目的基因已插入載體質(zhì)粒中。經(jīng)測序分析證明該基因序列與GenBank 中登錄的序列一致。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 分析 重組菌BL21/pET24a-aGzmA 的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖3 所示，重組菌經(jīng)IPGT 誘導(dǎo)后在相對分子質(zhì)量約26 kD 處有一特異蛋白條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌、誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)化菌BL21/pET24a、誘導(dǎo)的空白菌BL21 均未見此條帶。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)膜，分別與小鼠抗His 單克隆抗體和HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 二抗反應(yīng)，在相對分子質(zhì)量約26 kD 處可見特異性顯色條帶，而未誘導(dǎo)的重組菌、誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)化菌和誘導(dǎo)的空白菌均未見特異性顯色帶(圖4)。

圖1 人aGzmA 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis profile of PCR products of human aGzmA

圖2 重組質(zhì)粒pET24a-aGzmA 酶切鑒定圖譜Fig.2 Enzyme-digestion profile of recombinant plasmid pET24a-aGzmA

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed product

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of expressed product

2.5 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 將相同條件下接種的菌液分別在25℃、30℃、37℃條件下培養(yǎng)，其他條件嚴(yán)格保持一致，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對重組菌株表達(dá)目的基因有明顯影響，在25℃誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量較低，37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)量最高。當(dāng)菌液OD600值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、2.0 時(shí)，加入IPTG 于37℃誘導(dǎo)表達(dá)，不同OD600值的菌液經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，OD600值為0.2 時(shí)即有目的蛋白的表達(dá)，而在OD600值超過2.0 時(shí)目的蛋白不表達(dá)，但在OD600值為0.2～2.0 之間，蛋白表達(dá)量隨OD600值變化不明顯。在37℃條件下，分別加入IPTG 至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mmol/L 誘導(dǎo)表達(dá)，不同濃度IPTG 誘導(dǎo)后差別不大。加入相同濃度的IPTG，分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10 h，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，工程菌用IPTG 誘導(dǎo)2 h 即可看到有目的蛋白的表達(dá)，但隨著時(shí)間的延長，表達(dá)量并無明顯增加。

2.6 重組蛋白的純化 超聲破碎菌體后，分別收集上清和沉淀，取一定量的上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE 分析，目的蛋白主要位于沉淀中(圖略)，表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。將包涵體變性后利用鎳層析柱進(jìn)行分離純化，其結(jié)果見圖5，其純度可達(dá)90%以上，表明利用鎳柱親和層析法可得到純度較高的目的蛋白。

2.7 重組蛋白的活性檢測結(jié)果 見圖6。將重組蛋白作用于BLT 底物溶液后用酶標(biāo)儀測定其在412 nm 處的紫外光吸光度值，與對照組透析液(mock)相比，重組蛋白具有明顯的酶解BLT 底物溶液的活性，表明該重組蛋白具有較好的生物學(xué)活性，可用于其功能的研究。

圖5 純化蛋白的SDS-PAGGE 結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified protein

圖6 重組蛋白aGzmA 活性的檢測結(jié)果Fig.6 Activity assay of recombinant protein aGzmA

3 討論

顆粒酶A 在殺傷腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞及異體移植物的排異反應(yīng)中具有重要意義［9-11］。最近有研究關(guān)注顆粒酶A 的促炎癥作用［12，13］，但顆粒酶A如何激活炎癥因子的產(chǎn)生，其分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究闡明。為了獲得人顆粒酶A 重組蛋白以開展其相關(guān)生物學(xué)功能的研究，本研究利用PCR 從GzmA 全長基因中擴(kuò)增得到人顆粒酶A 基因活性段，插入到原核表達(dá)載體pET24a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)之中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET24a-aGzmA，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)了該重組蛋白。SDS-PAGE 結(jié)果及Western blot 分析顯示，該重組蛋白大小約為26 kD，可以與小鼠抗His 單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明人活性顆粒酶A 成功地進(jìn)行了表達(dá)，且其分子量與預(yù)期相符。為了使該蛋白在工程菌中大量表達(dá)，獲得最佳表達(dá)條件，本研究從誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、開始誘導(dǎo)時(shí)菌液濃度、誘導(dǎo)劑濃度4 個(gè)方面進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示，工程菌對溫度敏感，在37℃時(shí)能較好地表達(dá)人aGzmA 蛋白。工程菌在OD600值為0.2～2.0 之間，用IPTG 誘導(dǎo)2 h 后即可表達(dá)aGzmA，而IPTG 的濃度對重組蛋白的表達(dá)影響不大。將表達(dá)菌超聲破碎后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果顯示重組蛋白主要在沉淀中，表明該重組蛋白主要以包涵體形式存在。為了獲得具有生物學(xué)活性的重組蛋白，需要對表達(dá)蛋白進(jìn)行變性和復(fù)性處理。本研究中利用尿素溶解包涵體，從而可以利用親和層析進(jìn)行純化。為了便于純化蛋白，本研究將人活性顆粒酶A 基因與6 個(gè)His 共同表達(dá)，從而可以利用His 標(biāo)簽與鎳柱結(jié)合的特性進(jìn)行目的蛋白的分離和純化，蛋白純化的結(jié)果表明可以獲得高純度的目的蛋白。顆粒酶A 為絲氨酸蛋白酶，對多種底物具有水解活性。為了檢測所制備的人顆粒酶A 重組蛋白是否具有酶解活性，我們利用了BLT 底物溶液進(jìn)行了活性檢測，結(jié)果顯示該重組蛋白具有較好的生物學(xué)活性。Kummer 等［14］曾報(bào)道的人顆粒酶A 重組蛋白需要用組織蛋白酶C 處理后才能具有酶水解活性，而本研究中制備的重組蛋白為人顆粒酶A 活性段，去除了N 末端28 個(gè)氨基酸，該重組蛋白不用任何處理即具有酶水解活性，從而可以降低其制備成本。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開展其促炎作用等相關(guān)生物學(xué)功能的研究奠定了前期基礎(chǔ)。

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