謝榮華 譚 逵 吳 翔 舒衡平 (湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，衡陽 421005)

弓形蟲是一種人畜共患胞內(nèi)寄生的機(jī)會致病性原蟲，能感染人類及溫血?jiǎng)游?，引起人獸共患弓形蟲病，目前尚無理想的藥物治療弓形蟲病，研究弓形蟲疫苗預(yù)防弓形蟲病是目前此領(lǐng)域的熱點(diǎn)。弓形蟲疫苗有單表位和多表位疫苗，是利用基因重組技術(shù)將一個(gè)或者多個(gè)弓形蟲抗原表位的編碼基因連接在一起制成的疫苗，但單用弓形蟲疫苗的保護(hù)性效果不太理想，可用免疫調(diào)節(jié)劑來增強(qiáng)弓形蟲疫苗的免疫原性，產(chǎn)生更有效和持久的保護(hù)性免疫。本研究組在前期已成功構(gòu)建了弓形蟲W2b2a 表位疫苗質(zhì)粒，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗弓形蟲感染的保護(hù)性免疫［1］。匹多莫德(Pidotimod)化學(xué)名為(R)-3-［(S)-(5-氧-2-吡咯烷基)羰基］-噻唑烷基-4-甲酸，由焦谷氨酸和四氫噻唑羧酸兩個(gè)氨基酸組成的二肽，是一種全新的化學(xué)合成免疫調(diào)節(jié)劑，既能促進(jìn)非特異性免疫反應(yīng)又能促進(jìn)特異性免疫反應(yīng)［2］。沙利度胺(Thalidomid)化學(xué)名為3-鄰苯二甲酰亞胺基戊二酰亞胺，這是一個(gè)老藥新用的免疫調(diào)節(jié)劑，它能特異的調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF)-α 的水平。本文探討匹多莫德、沙利度胺免疫調(diào)節(jié)劑能否增強(qiáng)弓形蟲W2b2a 表位疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和保護(hù)免疫的效果。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 弓形蟲RH 株為本室傳代保種、pcDNA3、pcDNA3-W2b2a 為本室構(gòu)建。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級昆明小鼠，6 周齡左右，雌雄各半，體重為(20±2)g，購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 主要試劑與藥物 HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自北京博大泰克公司，F(xiàn)ITC-CD4、PE-CD8a 為Bioscience 公司產(chǎn)品;IFN-γ 檢測ELISA 試劑盒購自深圳晶美生物有限公司;細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自上海美季生物技術(shù)有限公司;FREUND 佐劑購自Sigma 公司;匹多莫德為太陽石(唐山)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;沙利度胺片，25 mg/片，國藥準(zhǔn)字H32026129，常州制藥廠有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組及動物免疫 昆明小鼠120 只，隨機(jī)分為6 組，雌雄各半，分別為Ⅰ組:pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒100 μl、Ⅱ組:pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒100 μl 加匹多莫德(200 mg/kg/d)、Ⅲ組:pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒100 μl 加沙利度胺(1.0 mg/只/d)、Ⅳ組:pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒100 μl 加弗氏佐劑組、Ⅴ組:pcDNA3 100 μl、Ⅵ組:生理鹽水100 μl。將定量的匹多莫德、沙利度胺、弗氏佐劑分別與pcDNA3-W2b2a 質(zhì)?；旌?，從小鼠左后腿肌肉注射，每次100 μl，共免疫3 次，每次間隔2 周，生理鹽水組和pcDNA3 組作對照。分別于免疫前及末次免疫后第2周、第4 周用斷尾法收集小鼠血清備用。

1.5 小鼠血清特異性抗體IgG 檢測 按試劑盒操作說明檢測各組免疫前及末次免疫后第2 周、第4周免疫鼠血清抗體IgG 水平。

1.6 小鼠血清IFN-γ 測定 小鼠末次免疫后2 周取血清測定IFN-γ，測定方法按試劑盒說明操作。

1.7 小鼠脾細(xì)胞懸液制備 小鼠末次免疫后2 周，在攻擊實(shí)驗(yàn)前，每組小鼠隨機(jī)處死8 只無菌取脾臟置于200 目銅網(wǎng)，研磨后用1640 培養(yǎng)液沖洗，收集脾細(xì)胞，破紅細(xì)胞后，用含10%小牛血清的1640 培養(yǎng)液吹打混勻，將脾細(xì)胞數(shù)調(diào)整至5 ×106ml-1，用于測定鼠脾細(xì)胞T 淋巴細(xì)胞亞群。

1.8 鼠脾細(xì)胞T 淋巴細(xì)胞亞群測定 PBS 調(diào)整小鼠脾細(xì)胞懸液密度至(1.6～1.9)×106個(gè)/ml 于BD公司專用試管中，每只小鼠設(shè)兩管，1 500 r/min 離心5 min，吸取900 μl 上清;加PE-CD8α、FITC-CD4、PE-Cy5-CD3e 單抗各5 μl，混勻10 s，室溫避光放置30 min，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，每管加入2 ml PBS 溶液，混勻10 s，1 500 r/min 離心5 min，棄上清;用PBS 溶液洗滌一次;加1%多聚甲醛100 μl，混勻10 s，在BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀上用CELLQuest 軟件獲取CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算CD4+T 淋巴細(xì)胞與CD8+T 淋巴細(xì)胞比值。

1.9 免疫鼠脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8 法) 將各組脾細(xì)胞懸液100 μl(2 ×104ml-1)分別加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每組設(shè)2 個(gè)復(fù)孔和對照孔)，各組分別加入ConA，(終濃度為10 μg/ml)對照孔加入ConA，37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h 各孔加入10 μl CCK-8 試劑。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去100 μl 上清，測定時(shí)每孔加入二甲亞砜(DMSO)100 μl，振蕩溶解，用酶標(biāo)儀測定吸光度(A450 值)。

1.10 攻擊感染實(shí)驗(yàn) 末次免疫后第4 周，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠經(jīng)腹腔注射弓形蟲RH 株速殖子(500個(gè)/鼠)，觀察記錄小鼠的感染情況和死亡時(shí)間。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5 非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。以±s 表示，表格采用Excel 制圖。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清特異性IgG 抗體水平 各免疫組小鼠特異性IgG 抗體均高于對照組(P ＜0.05)，且均于末次免疫后第4 周達(dá)到最高值;Ⅱ組pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、Ⅳ組pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組IgG 抗體水平較Ⅰ組pcDNA3-W2b2a 組和Ⅲ組pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組同期要高(P ＜0.05)(圖1)。

2.2 免疫小鼠血清IFN-γ 檢測 按試劑盒提供的IFN-γ 標(biāo)準(zhǔn)品所測OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所測得的小鼠血清OD 值換算成IFN-γ 濃度(pg/ml)(表1)，Ⅱ組pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德、Ⅳ組pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑、Ⅲ組pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺小鼠血清IFN-γ 水平明顯高于pcDNA3-W2b2a 組和對照組(P ＜0.01)。

圖1 ELISA 法檢測小鼠血清IgG 的結(jié)果Fig.1 Detection of IgG in sera of mice by ELISA

表1 小鼠血清IFN-γ 濃度(pg/ml)、鼠脾細(xì)胞亞群檢測(%)Tab.1 Detection of concentration of cytokine IFN-γ in serum and leukomonocyte subpopulation of splenoctes from immunized mice

表2 速殖子攻擊后各組小鼠存活時(shí)間(±s)Tab.2 Survival time of mice in different groups after challenged with tachyzoite(±s)

表2 速殖子攻擊后各組小鼠存活時(shí)間(±s)Tab.2 Survival time of mice in different groups after challenged with tachyzoite(±s)

Note:Ⅰ.pcDNA3-W2b2a;Ⅱ.pcDNA3-W2b2a and Pidotimod;Ⅲ.pcDNA3-W2b2a and Thalidomid;Ⅳ.pcDNA3-W2b2a and Freund adjuvant;V.pcDNA3;Ⅵ.Nacl;1)compared with control groups，P ＜0.01.

圖2 速殖子攻擊后各組小鼠存活率Fig.2 Survival rate of mice in different groups after challenged with tachyzoite

2.3 鼠脾細(xì)胞T 淋巴細(xì)胞亞群測定 小鼠末次免疫后第2 周，取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行T 淋巴細(xì)胞亞群測定，pcDNA3-W2b2a 組、pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組、pcDNA3-W2b2a加弗氏佐劑組與對照組比較CD4+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量增多;pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組CD4+/CD8+比值明顯高于pcDNA3-W2b2a 組和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組(表1)。

2.4 免疫鼠脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8) 末次免疫后二周，ConA 刺激小鼠脾T 細(xì)胞，免疫組小鼠脾細(xì)胞均發(fā)生增殖。各組脾細(xì)胞增殖活性如下(加ConA孔的A 值與不加ConA 孔的A 值的比值):pcDNA3-W2b2a:1.12，pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組:1.98，pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺:1.34，pcDNA3-W2b2a加弗氏佐劑:2.03，各免疫組脾淋巴細(xì)胞增殖能力與兩對照組比較明顯增強(qiáng)(P ＜0.05)。

2.5 抗攻擊感染的免疫保護(hù)作用 末次免疫后第四周每只小鼠經(jīng)腹腔注射500 個(gè)弓形蟲速殖子，實(shí)驗(yàn)小鼠均不能耐受弓形蟲攻擊感染。疫苗組小鼠存活時(shí)間明顯長于pcDNA3 組及生理鹽水組(P ＜0.05)，且pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組小鼠存活時(shí)間長于pcDNA3-W2b2a 組和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組(P ＜0.05)，說明匹多莫德能增強(qiáng)弓形蟲W2b2a 表位疫苗抗弓形蟲感染的免疫力(表2，圖2)。

3 討論

免疫調(diào)節(jié)劑匹多莫德是一種安全有效的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，既能促進(jìn)非特異性免疫反應(yīng)又能促進(jìn)特異性免疫反應(yīng)［2］。動物和人體試驗(yàn)均表明，本品具有良好的安全性和耐受性，克服了生物來源免疫調(diào)節(jié)劑的不良反應(yīng)。王為為等［3］研究匹多莫德能夠顯著激活地塞米松誘導(dǎo)的免疫抑制，抑制地塞米松誘導(dǎo)的小鼠弓形蟲隱性感染活化，其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有Th1 和Treg 細(xì)胞的參與;國外，Tan 等［4］研究口服匹多莫德對正常和免疫功能低下的小鼠的免疫功能有明顯的增強(qiáng)作用，使免疫功能低下時(shí)降低的輔助性T 細(xì)胞(CD4+)與抑制性T 細(xì)胞(CD8+)的比值恢復(fù)正常;謝榮華［5］研究證實(shí)匹多莫德可增強(qiáng)弓形蟲GRA1 蛋白抗弓形蟲感染的免疫效果;趙瑩等［6］報(bào)道匹多莫德具有一定的體外抑制弓形蟲速殖子增殖的作用，匹多莫德與磺胺甲惡唑聯(lián)合應(yīng)用既能降低磺胺甲惡唑用量又能有效抑蟲。沙利度胺是一種合成谷氨酸衍生物，曾名反應(yīng)停，具有鎮(zhèn)靜、止吐的作用，后發(fā)現(xiàn)該藥有強(qiáng)烈致畸而被禁用。2006 年又被批準(zhǔn)用于與地塞米松聯(lián)合治療多發(fā)性骨髓瘤。沙利度胺對多種腫瘤都具有抗血管生成作用，但因其具有過多的不良反應(yīng)，限制了其長期應(yīng)用。研究者通過對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，開發(fā)了新一代的沙利度胺類似物pomalidomide 具有T 細(xì)胞共同刺激作用，激活T 細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)［7］;沙利度胺可以刺激細(xì)胞毒性T 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其分泌具有直接抗腫瘤作用的干擾素γ (IFN-γ)和IL-2［8］。對于沙利度胺的研究還在繼續(xù)，隨著研究的深入，幾乎無致畸性的沙利度胺衍生物將會面世。

表位疫苗已在寄生蟲疫苗的研究中獲得滿意的免疫效果［9］，本課題組在前期成功構(gòu)建弓形蟲多表位疫苗pcDNA3-W2b2a 并證實(shí)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的抗弓形蟲感染的作用［1］，本次研究結(jié)果顯示:pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組、pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組小鼠血清IFN-γ 水平顯著高于pcDNA3-W2b2a 組。pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組IgG 抗體水平、CD4+/CD8+比值、T 細(xì)胞增殖活性顯著高于pcDNA3-W2b2a 質(zhì)粒組和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺組，免疫組抗體水平均在末次免疫后第四周最高。小鼠攻擊試驗(yàn)表明，免疫組小鼠存活時(shí)間明顯長于對照組(P ＜0.05)，且pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德組、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐劑組小鼠存活時(shí)間長于其他免疫組。匹多莫德、沙利度胺與弗氏佐劑可增強(qiáng)弓形蟲新基因W2b2a 表位疫苗免疫小鼠的保護(hù)作用。其中匹多莫德作用接近于弗氏佐劑，但副作用顯著低于后者，可望用于弓形蟲亞單位疫苗的研制。

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