王吉明，李楠楠，尚建立，李娜，徐永陽(yáng)，馬雙武

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，河南鄭州450009)

西瓜枯萎病是由半知菌亞門(mén)鐮孢屬尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusarium oxysporum f．sp．niveurn)寄生引起的一種世界性真菌土傳病害，嚴(yán)重制約西瓜的生產(chǎn)［1-4］。目前西瓜抗枯萎病育種主要采用人工接種鑒定技術(shù)進(jìn)行抗性選擇，易受環(huán)境和接種技術(shù)的影響，存在鑒定時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確性差、鑒定效率低等缺點(diǎn)，分子標(biāo)記技術(shù)鑒定具有不易受環(huán)境影響，鑒定時(shí)間短，準(zhǔn)確性高，鑒定效率高等優(yōu)點(diǎn)，可作為分子輔助選擇的重要工具，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究者已對(duì)西瓜枯萎病病菌1號(hào)生理小種的抗病基因(Fon-1)進(jìn)行定位［5-8］。筆者采用張屹等［8］發(fā)表的西瓜枯萎病生理小種1抗性基因緊密連鎖Caps標(biāo)記“fon_7716”對(duì)130份不同類型西瓜種質(zhì)進(jìn)行抗性基因分子檢測(cè)分析，以期為西瓜抗枯萎病抗原篩選和分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 供試材料為國(guó)家西瓜甜瓜中期庫(kù)(河南，鄭州)提供的西瓜種質(zhì)資源，包括地方品種、育成品種(系)和野生種質(zhì)，共計(jì)130份(表1)，具有較為廣泛的代表性。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 DNA提取。于西瓜果實(shí)膨大期取蔓上幼嫩真葉用于基因組 DNA的提取，采取 CTAB法提取基因組 DNA［9］。

1．2．2 PCR 反應(yīng)體系。擴(kuò)增反應(yīng)體系 25 μl，包括 12．5 μl 2×Taq Master Mix，2 μl模板 DNA，10 μmol/μl上、下游混合引物2μl，ddH2O 8．5μl。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性 5 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min;4℃保存。2×Taq Master Mix購(gòu)自北京百泰客生物技術(shù)有限公司。引物7716_fon為張屹等［8］已發(fā)表的西瓜抗枯萎病基因分子標(biāo)記，由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。7716_fon 引 物 序 列 為:5′-TTAAAAATCATCTCCTCTTTAAAACTATT-3′，5′-ATATATTTGGTCTCCGAGTGTTCAA-3′。

1．2．3 CAPS反應(yīng)與分析。PCR產(chǎn)物采用 Taq I進(jìn)行酶切，酶切識(shí)別位點(diǎn)為T(mén)′CGA，酶切體系為 15 μl，含有 1．5 μl 10 ×Buffer;1．0 μl限制內(nèi)切酶Taq I;5 μl PCR 產(chǎn)物，7．5 μl H2O。酶切程序:65℃酶切16 h，80℃變性20 min，4℃保存。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司。

擴(kuò)增/酶切產(chǎn)物采用8．0%聚丙烯酰胺電泳，280 V恒定電壓下電泳50 min，銀染顯色后拍照分析;PCR產(chǎn)物酶切后電泳出單條帶170 bp判定為抗病基因型，出現(xiàn)單條帶104 bp為感病基因型，同時(shí)出現(xiàn)170和104 bp 2條帶為抗/感病雜合基因型。

2 結(jié)果與分析

2．1 PCR及Caps酶切結(jié)果 130份西瓜種質(zhì)資源的總DNA提取后均擴(kuò)增出170 bp條帶，但條帶較淺;采用Taq I酶切后部分種質(zhì)的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)104 bp條帶和一條70 bp左右的條帶，將170 bp和104 bp條帶判定為抗病和感病基因型(圖1)。

2．2 種質(zhì)資源基因型鑒定 在130份種質(zhì)資源中，45份種質(zhì)資源表型為抗病基因型(+)，80份種質(zhì)資源為感病基因型(-)，5份種質(zhì)資源為抗/感病雜合基因型(+/-)(表1)。

2．2．1 地方品種基因型鑒定。在34份地方品種類型種質(zhì)資源中，21份種質(zhì)鑒定為抗病基因型，占供試地方品種總數(shù)的61．8%?？共』蛐头N質(zhì)包括著名的地方品種三白瓜、撫州瓜、馬鈴瓜、喇嘛瓜、陜西白、黑崩筋等食用西瓜，以及鄭州籽瓜、大板紅籽瓜、皋蘭籽瓜、寧夏紅籽瓜、大安子瓜等籽瓜。

2．2．2 野生種質(zhì)資源基因型鑒定。選用13份野生種質(zhì)進(jìn)行了抗性基因型鑒定，結(jié)果鑒定出3份抗病基因型種質(zhì)，分別為PI 494530、PI 494528、PI 595203，占供試野生種質(zhì)總數(shù)的23．1%，其余均為感病基因型種質(zhì)。

2．2．3 育成品種基因型鑒定。在82份育成品種(系)類型種質(zhì)資源中，鑒定出21份抗病基因型種質(zhì)，主要為久比例、Smokylee、Sugarlee等國(guó)外育成品種，以及紅1號(hào)、中育10號(hào)、中育1號(hào)和96B41等國(guó)內(nèi)育成品種(系)，占供試育成品種(系)種質(zhì)總數(shù)的25．6%;另鑒定出5份雜合基因型種質(zhì)，分別為 Jan-06、All Sweet、Dixielee、開(kāi)雜5 號(hào)-1、AB 系;其余為感病基因型種質(zhì)，主要為查理斯頓、Black Stone、Calhoun Gray、Black diamond、Crimson Sweet等國(guó)外育成品種和中育9號(hào)、興城紅、火洲1號(hào)、無(wú)杈早、蘇蜜1號(hào)、中汴一號(hào)等國(guó)內(nèi)育成品種。

表1 西瓜種質(zhì)資源抗枯萎病生理小種1基因型鑒定

續(xù)表1

3 討論

該研究采用Caps標(biāo)記“Fon_7716”對(duì)我國(guó)部分西瓜種質(zhì)資源包括地方品種、野生種質(zhì)、育成品種(系)3種不同類型的種質(zhì)資源進(jìn)行了抗枯萎病生理小種1的基因型鑒定，結(jié)果表明抗性基因型種質(zhì)比例偏高，如我國(guó)地方西瓜品種通常認(rèn)為不抗枯萎病，但在34份我國(guó)地方西瓜品種中，有21個(gè)品種表現(xiàn)為抗病基因型，抗性種質(zhì)比例高達(dá)61．8%，表明抗性基因型和表型抗性性狀之間出現(xiàn)一定的偏差，推測(cè)不同類型種質(zhì)資源之間存在較大的抗性背景遺傳差異，有待進(jìn)一步研究;此外一些公認(rèn)的抗性種質(zhì)如PI296341是目前認(rèn)為兼抗枯萎病生理小種0、1、2的材料，而Calhoun Gray則是開(kāi)發(fā)“Fon_7716”標(biāo)記的抗性親本材料，這些種質(zhì)在該研究中均表現(xiàn)為感病基因型，出現(xiàn)這種情況可能與采用的試驗(yàn)材料與之前報(bào)道用的材料來(lái)源不同，或在繁殖更新過(guò)程中抗性基因丟失有關(guān)。在育成品種(系)中，Sugarlee、Smokylee、紅1號(hào)等是抗枯萎病育種中較為常用的抗性材料，該研究鑒定為抗病基因型，與表型抗性性狀相符。

不同西瓜種質(zhì)資源材料其抗病基因可能各不相同，抗性遺傳和表型規(guī)律也相差很大，枯萎病抗性遺傳可能受多個(gè)基因協(xié)同控制［10-18］，采用單一分子標(biāo)記難以全面從整個(gè)種質(zhì)資源角度篩選和鑒定抗性種質(zhì)，因此十分有必要繼續(xù)從分子水平開(kāi)展枯萎病的抗性遺傳和抗性機(jī)理研究，并開(kāi)發(fā)更多緊密連鎖的分子標(biāo)記。

［1］徐潤(rùn)芳，楊鼎新．我國(guó)西瓜抗枯萎病育種的進(jìn)展與前景［J］．中國(guó)西瓜甜瓜，1992(1):2-5．

［2］周鳳珍，康國(guó)斌．西瓜部分抗枯萎病材料的抗性遺傳研究［J］．中國(guó)西瓜甜瓜，1996(2):17-18．

［3］ZHANGZ G，ZHANGJY，WANG Y C，et al．Molecular detection of Fusarium oxysporum f．sp．niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil［J］．FEMSmicrobiol lett，2005，249(1):39-47．

［4］徐瑞富，劉軟林，劉起麗，等．西瓜枯萎病菌的生物學(xué)特性研究［J］．河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013(2):36-40．

［5］XU Y，OU Y X，ZHANG H Y，et al．Identification of a RAPD marker linked to Fusarium wilt resistant gene in wild watermelon germplasm(Citrullus lanatus var．citroides)［J］．Acta botanicasinica，1999，41(9):952-955．

［6］許勇，張海英，康國(guó)斌，等．西瓜抗枯萎病育種分子標(biāo)記輔助選擇的研究［J］．遺傳學(xué)報(bào)，2000，27(2):151-157．

［7］LEIGH K，F(xiàn)ENNY D．Draft of RAPD map of watermelon［J］．American society for horticultural science，2001，126(3):344-350．

［8］張屹，張海英，郭紹貴，等．西瓜枯萎病菌生理小種1抗性基因連鎖標(biāo)記開(kāi)發(fā)［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46(10):2 085-2 093

［9］MURRAY M G，THOMPSON W F．Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］．Nucleic acids research，1980，8(19):4 321-4 325．

［10］GRALL J M．History and present status of watermelon improvement by breeding［J］．Soil Sci，1953，13:71-74．

［11］HENDERSON WR．The inheritance of Fusarium wilt resistance in watermelon［J］．JAm Soc Hort Sci，1970，95:276-282．

［12］NETZER D．Inheritance of resistance in watemelon to races of Fusarium oxysporurn［J］．Plant disease，1980，164(9):853-854．

［13］黃學(xué)森，張學(xué)煒，焦定量，等．西瓜部分品種抗枯萎病特性在 F1代中遺傳表現(xiàn)的初步探討［J］．中國(guó)西瓜甜瓜，1991(2):11-15．

［14］ZHANGX P，RHODESB．Inheritance of resistance to race0，1 and 2 of Fusarium oxysporum f．sp．niveum in Watermelon(Citrullus sp．P1296341)［J］．CGCreport，1993，16:77-78．

［15］周鳳珍，康國(guó)斌．西瓜抗枯萎病品種“卡紅”的抗病遺傳研究［J］．植物病理學(xué)，1996，26(3):261-262．

［16］張國(guó)良，崔廣海．西瓜枯萎病抗性材料的轉(zhuǎn)育及遺傳規(guī)律的研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，27(6):616-618．

［17］于利，徐潤(rùn)芳，趙有為．西瓜品種抗枯萎病遺傳研究［J］．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1995，11(1):45-48．

［18］羊杏平，姚懷蓮，劉廣，等．西瓜品種枯萎病抗性的遺傳研究［J］．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24(6):882-887．