李 佳，李 艷,2，牟德華,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

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16S rDNA PCR-RFLP分析鑒定開菲爾發(fā)酵劑中的乳酸菌

李 佳1，李 艷1,2，牟德華1,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

摘 要：對傳統(tǒng)乳制品開菲爾發(fā)酵劑通過菌種分離和純化得到67 株乳酸菌，經(jīng)過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類區(qū)分成6 種形態(tài)類型。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行16S rDNA限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析法鑒定為4 種分子類型，分別為：乳明串株菌（L. lactis）、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（E. durans）、意大利腸球菌（E. italicus）、嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）。其中堅(jiān)強(qiáng)腸球菌菌數(shù)超過50%，占所分離菌株的62.7%，為優(yōu)勢菌。

關(guān)鍵詞：開菲爾發(fā)酵劑；乳酸菌；16S rDNA PCR-RFLP

開菲爾（Kefir）是一種發(fā)酵乳，起源于俄羅斯北高加索地區(qū)，與普通酸奶不同，它是由數(shù)10 種乳酸菌及酵母菌所形成的復(fù)合型發(fā)酵劑開菲爾粒發(fā)酵形成的復(fù)合型發(fā)酵乳，是復(fù)雜微生物的共生體[1-2]。開菲爾能改善消化機(jī)能，提高鈣的利用率，對腸道疾病、高血壓、心臟病、腦血栓、心肌梗塞等有預(yù)防和緩解作用[3-4]。開菲爾發(fā)酵劑包括開菲爾粒和開菲爾發(fā)酵液。農(nóng)牧民長期把牛奶裝在羊皮口袋內(nèi)，經(jīng)過自然發(fā)酵而形成不規(guī)則的乳白色或淺黃色顆粒狀物，稱為開菲爾粒[5]，開菲爾發(fā)酵液是利用開菲爾粒在牛奶中生長而獲得的發(fā)酵液。開菲爾發(fā)酵劑中含有多種益生微生物，包括多種乳酸菌和酵母菌。在發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)過程中，只能使用增殖后的牛奶作為新的發(fā)酵劑，這種傳統(tǒng)的傳代方式使開菲爾發(fā)酵劑極不穩(wěn)定，容易造成雜菌的污染[6]，限制了傳統(tǒng)開菲爾發(fā)酵乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)，以及新型動物性和植物性發(fā)酵乳產(chǎn)品的開發(fā)。因此篩選優(yōu)良性能的乳酸菌，并開發(fā)研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的發(fā)酵劑，對我國發(fā)酵乳制品工業(yè)的發(fā)展有重要意義。

目前，乳酸菌的分子鑒定廣泛采用16S rDNA 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析技術(shù)[7-8]，或與其他鑒定技術(shù)結(jié)合進(jìn)行乳酸菌鑒定。16S rDNA具有保守性和高變性，RFLP技術(shù)是用不同的限制性內(nèi)切酶對細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行電泳分析用于對比不同基因組件的核苷酸差異。16S rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)與RFLP技術(shù)結(jié)合，可以把乳酸菌鑒定到種水平[9]。本研究從開菲爾粒和開菲爾發(fā)酵液中分離篩選乳酸菌，并進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)分類和分子生物學(xué)鑒定，為篩選具有優(yōu)良性狀的乳酸菌，并進(jìn)一步開發(fā)新型動物性和植物性原料發(fā)酵乳奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)基

開菲爾粒和開菲爾發(fā)酵液均取自內(nèi)蒙古自治區(qū)牧區(qū)的牧民家中，共計(jì)414 個(gè)樣品。

MRS培養(yǎng)基[10]：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、碳酸鈣10 g/L、酵母浸粉5 g/L、檸檬酸氫二胺2 g/L、乙酸鈉2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、吐溫-80 1 mL/L、瓊脂18 g/L。pH 6.2～6.6，121 ℃滅菌20 min。

1.2試劑與設(shè)備

引物27F（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’），1495R（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）[11]由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；HaeⅢ，HinfⅠ，HhaⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA Marker 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

PCR儀、凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司；瓊脂糖水平電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1 乳酸菌的分離

取1 g開菲爾粒研磨，加入10 mL無菌水溶解，搖勻進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇3 個(gè)適宜的稀釋度，取0.2 mL稀釋液于MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，從平板上挑取乳酸菌，再在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純培養(yǎng)取得單菌落[12]，保藏。

1.3.2 乳酸菌的形態(tài)聚類

將分離得到的乳酸菌進(jìn)行復(fù)篩，接種在MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4 d，觀察乳酸菌的菌落顏色、形態(tài)、邊緣是否平整、表面的光滑程度等菌落特征。同時(shí)進(jìn)行過氧化氫實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色和顯微鏡觀察，并記錄細(xì)胞的顯微形態(tài)，以此對乳酸菌進(jìn)行初步的形態(tài)聚類和保藏。

1.3.3 乳酸菌的分子鑒定

乳酸菌的分子鑒定采用16S rDNA PCR-RFLP序列分析法。將初步形態(tài)聚類的乳酸菌每種形態(tài)分別隨機(jī)選取一株進(jìn)行分子鑒定，十六烷基三甲基溴化胺（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[13-14]提取乳酸菌DNA，PCR擴(kuò)增采用通用引物，正向引物為27F：5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’；反向引物為1495R：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’。

PCR反應(yīng)體系包括：雙蒸水34.6 μL，10×Buffer 10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L的正向引物2 μL，10 μmol/L的反向引物2 μL，DNA模板2 μL，5 U/μL Taq酶0.4 μL，反應(yīng)總體積為50 μL。

PCR反應(yīng)程序[15]：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，變性 1 min，58 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min。將得到的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳條件為：電壓90 V，時(shí)間50 min，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色20 min，凝膠成像分析儀進(jìn)行觀察并攝影。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切分析（20 μL）：雙蒸水7 μL，5×Buffer 2 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，分別用0.5 U/μL HhaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ 內(nèi)切酶[16]1 μL進(jìn)行酶切。酶切條件均為：37 ℃水浴2.5 h，取出，酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，酶切產(chǎn)物加樣量8 μL與1 μL的10×Loading Buffer混勻后加樣，加入5 μL的Marker為對照，電泳電壓90 V，時(shí)間50 min。EB染色20 min，凝膠成像分析儀下進(jìn)行觀察并攝影。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的分離與形態(tài)聚類

開菲爾發(fā)酵劑經(jīng)MRS培養(yǎng)基的分離純化共得到67 株乳酸菌，均為過氧化氫實(shí)驗(yàn)陰性、革蘭氏染色陽性的菌株。根據(jù)菌落顏色和形態(tài)特征，結(jié)合顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)共分為6 種類型，結(jié)果見表1。

表1　MRS培養(yǎng)基上分離乳酸菌的菌落形態(tài)及數(shù)量和比例Table 1 Morphological characteristics, proportion and number of lactic acid bacteria on MRS

不同種類的乳酸菌生長在MRS培養(yǎng)基上，其菌落顏色、形態(tài)、大小等都有所不同，結(jié)合菌落形態(tài)和細(xì)胞的顯微形態(tài)可進(jìn)行乳酸菌的判斷和區(qū)分。由表1可知，形態(tài)2的乳酸菌在開菲爾發(fā)酵劑樣品中數(shù)量最多，占所分離乳酸菌的62.7%，超過50%，為優(yōu)勢菌群，其菌落形態(tài)和細(xì)胞顯微形態(tài)如圖1所示。

圖1　優(yōu)勢乳酸菌的菌落（a）以及細(xì)胞顯微（b）形態(tài)（40×）Fig.1 Morphology of the predominant lactic acid bacteria colonies (a) and cells (b) (40×)

2.2乳酸菌的16S rDNA PCR-RFLP序列分析

乳酸菌的16S rRNA約含有1 540 個(gè)堿基，結(jié)構(gòu)既具有保守性，又具有高變性，16S rDNA是編碼核糖體RNA對應(yīng)的DNA序列，其原理是從乳酸菌中通過克隆測序或酶切探針雜交獲得16S rDNA序列信息，可作為鑒定乳酸菌的分類依據(jù)[17-19]。本研究在對分離得到的乳酸菌進(jìn)行菌落及顯微形態(tài)區(qū)分的基礎(chǔ)上，分別從每種形態(tài)類型中隨機(jī)選擇1 株乳酸菌進(jìn)行16S rDNA PCR-RFLP序列分析，6 種形態(tài)乳酸菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。同時(shí)使用HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，酶切電泳結(jié)果見圖3。

圖2　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of PCR-amplified products of 16S rDNA

圖3　PCR產(chǎn)物的3 種限制性內(nèi)切酶酶切分析圖譜Fig.3 Restriction analysis pattern of PCR-amplified products of 16S rDNA

由圖2可知，6 種乳酸菌的PCR擴(kuò)增片段大小都在1 500 bp左右，經(jīng)過HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后，可以將其區(qū)分為4 種分子類型。Ⅰ類：形態(tài)1，PCR產(chǎn)物大小1 492 bp，第1泳道HhaⅠ酶切為4 段：539、409、378、140 bp；第7泳道由HinfⅠ酶切為2 段：1 101、262 bp；第13泳道經(jīng)HaeⅢ酶切為3 段：870、369、177 bp。Ⅱ類：形態(tài)2，PCR產(chǎn)物為1 492 bp，第2泳道經(jīng)HhaⅠ酶切為4段：541、413、382、222 bp；第8泳道由HinfⅠ酶切為4 段：598、457、312、284 bp；第14泳道經(jīng)HaeⅢ酶切為3 段：即867、373、170 bp。Ⅲ類：形態(tài)3、5，PCR產(chǎn)物1 492 bp，第3和第5泳道經(jīng)HhaⅠ酶切為4段：535、411、377、219 bp；第9和第11泳道由HinfⅠ酶切為3 段：597、455、269 bp；第15和第17泳道經(jīng)HaeⅢ酶切為3 段：934、332、166 bp。Ⅳ類：形態(tài)4、6，PCR產(chǎn)物1 484 bp，第4和第6泳道經(jīng)HhaⅠ酶切為4 段：585、530、373、216 bp；第10和第12泳道由HinfⅠ酶切為3段，即595、453和300 bp；第16和第18泳道由HaeⅢ酶切為4 段：473、399、321、162 bp。

根據(jù)乳酸菌16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物及3 種限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物電泳圖，利用Image Lab軟件對PCR以及酶切條帶進(jìn)行解讀，不同形態(tài)類型的乳酸菌16S rDNA分析結(jié)果，即PCR產(chǎn)物分子質(zhì)量大小和酶切片段分子質(zhì)量大小見表2。

表2　6種不同類型的乳酸菌16S rDNA PCR-RFLP分析結(jié)果Table 2 results of PFLP analysis of 16S rDNA region for lactic acid bacteria

由表2可知，通過比較不同形態(tài)的乳酸菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切片段大小，能夠?qū)⑦@6 種不同形態(tài)類型的酵母菌區(qū)分為4 種分子類型。乳酸菌的PCR產(chǎn)物分子質(zhì)量大小為1 484～1 492 bp。經(jīng)限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶切分析后得到4 種不同的酶切片段類型。

把4 種分子類型的乳酸菌隨機(jī)選擇1 株進(jìn)行基因測序，將所得基因序列結(jié)果登陸GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.Cgi）相似性比對[20-21]，以相似度大于99%確定其屬種，測序結(jié)果見表3。

表3　乳酸菌16S rDNA序列分析Table 3 results of 16S rDNA sequence Analysis for lactic acid bacteria

由表3可知，經(jīng)過形態(tài)學(xué)區(qū)分和分子生物學(xué)鑒定（16S rDNA PCR-RFLP分析），可以將6 種形態(tài)的乳酸菌歸為4 種，分別為乳明串株菌（L. lactis）、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（E. durans）、意大利腸球菌（E. italicus）、嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）。

通過鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹判斷乳酸菌的同源關(guān)系[22]，如圖4所示。在系統(tǒng)發(fā)育樹上同一分支的乳酸菌同源關(guān)系最近，由圖4的聚類結(jié)果可以清楚地看出所分離乳酸菌的分類情況及各自的種屬名稱。

圖4　基于16S-rDNA序列和 Neighbor-Joining 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the sequences of 16S rDNA region and neighbor-jointing method

3　結(jié) 論

本研究對傳統(tǒng)乳制品開菲爾發(fā)酵劑中分離到的67 株乳酸菌通過形態(tài)聚類分為6 種形態(tài)類型，16S rDNA PCRRFLP法鑒定為4 種分子類型，其中堅(jiān)強(qiáng)腸球菌為優(yōu)勢菌群。本研究將傳統(tǒng)乳酸菌的形態(tài)學(xué)分析與現(xiàn)代分子技術(shù)相結(jié)合，通過基因序列分析使菌種鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提高。研究結(jié)果可以反映傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的多樣性，為進(jìn)一步開發(fā)研究新型動物性或植物性蛋白乳發(fā)酵飲料奠定了理論基礎(chǔ)。

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Analysis of Lactic Acid Bacteria in Kefir Starter by 16S rDNA PCR-RFLP

LI Jia1, LI Yan1,2, MOU Dehua1,*
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China)

Abstract:Lactic acid bacteria in kefir starter cultures were analyzed and identified to obtain strains with outstanding genetic traits and excellent fermentation characteristics. A total of 67 lactic acid bacteria strains were obtained directly from kefir starter cultures by isolation and streak plating. All of these stains could be divided into 6 different groups by conventional microbiological analysis. Then 4 genotypes were classified by RFLP analysis of the 16S rDNA region, including L. lactis, E. durans, E. italicus and S. thermophilus. E. durans was the dominant species accounting for 62.7% of all the isolates.

Key words:kefir starter cultures; lactic acid bacteria; 16S rDNA PCR-RFLP

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507029

中圖分類號：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0158-04

*通信作者：牟德華（1960—），男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：dh_mou@163.com

作者簡介：李佳（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：974705395@qq.com

收稿日期：2014-07-11