丁順杰，傅 裕，鐘雨珅，丁曉雯*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

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酶法降解鴨腸中膽固醇對(duì)鴨腸品質(zhì)的影響

丁順杰，傅 裕，鐘雨珅，丁曉雯*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

摘 要：目的：研究酶法降解鴨腸中膽固醇對(duì)其品質(zhì)的影響，為工業(yè)化生產(chǎn)低膽固醇鴨腸提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法：自制膽固醇氧化酶粗酶降解鴨腸中膽固醇；分光光度法測(cè)定膽固醇含量；質(zhì)構(gòu)剖面分析法（texture profile analysis，TPA）和色差分析法測(cè)定鴨腸質(zhì)地及色澤變化。結(jié)果：經(jīng)粗酶處理的鴨腸膽固醇含量為26.31 mg/g，降解率為25.81%；揮發(fā)性鹽基總氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量為13.30 mg/100 g，pH 6.87，硬度為10 459.10 g，彈性為0.96，咀嚼性為6 816.36 g，鴨腸內(nèi)、外壁亮度值分別為60.52、62.23。結(jié)論：自制膽固醇氧化酶粗酶可以有效降解鴨腸膽固醇，對(duì)其感官品質(zhì)有一定的改善。

關(guān)鍵詞：鴨腸；膽固醇氧化酶；膽固醇；感官品質(zhì)

隨著人們生活水平的提高，越來(lái)越多的特色菜品出現(xiàn)在火鍋餐桌上，如鴨腸、鵝腸、豬腦花、毛肚、魷魚(yú)等，但它們大都含有較高的膽固醇，對(duì)人們的健康有一定的不利影響，高膽固醇是引起高血脂、冠心病、動(dòng)脈硬化和心肌梗塞等病癥的重要因素[1]。因此，減少和控制膳食中高膽固醇的攝入量對(duì)預(yù)防心腦血管疾病至關(guān)重要。

目前，降低食品中膽固醇方法可分為物理法、化學(xué)法和微生物法三大類(lèi)，其中物理和化學(xué)方法都存在影響食品安全性、膽固醇降解率較低等缺陷[2]，而利用膽固醇氧化酶降解食品中的膽固醇作為一種安全高效的方式成為研究熱點(diǎn)[3-7]，但該方法應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)由于成本較高，導(dǎo)致實(shí)用性不夠。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)短桿菌（Brevibacterium sp.）產(chǎn)生含膽固醇氧化酶的粗酶液直接處理鴨腸，考察粗酶液對(duì)鴨腸膽固醇降解能力、鴨腸品質(zhì)的影響，期望為工業(yè)化應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮鴨腸為麻鴨的小腸，購(gòu)于重慶百貨大樓北碚超市二店。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇（純度≥95%）、石油醚（沸程：30～60 ℃）、冰乙酸（純度≥99.5%）、硫酸鐵銨等均為分析純 成都科龍化工試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

TA.XT2i物性測(cè)定儀 英國(guó)Stable Micro Systems Ltd公司；SC-80C全自動(dòng)色差計(jì) 北京康光儀器有限公司；B-260恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；XW-80A旋渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；pHS-3C型酸度計(jì)成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3方法

1.3.1 粗酶液的制備和提取

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，短桿菌產(chǎn)膽固醇氧化酶的最佳發(fā)酵條件為28 ℃，培養(yǎng)基pH 7.5，裝液量60 mL/250 mL，接種量6%，發(fā)酵時(shí)間28 h，此時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)1 397.80 U/L。將生產(chǎn)的粗酶液置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹8]。

1.3.2 酶法降解鴨腸膽固醇的工藝

鴨腸預(yù)處理：剔除新鮮鴨腸表面脂肪，用干紗布吸干水分，放入食品專(zhuān)用保鮮袋于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

粗酶液配制：參照參考文獻(xiàn)[9]提供的方法，測(cè)定自制粗酶液的酶活力，用pH 7.1的磷酸鹽緩沖溶液將其稀釋為0.12 U/L備用。

新鮮鴨腸酶解過(guò)程如下：

粗酶組：稱(chēng)取1.0 g新鮮鴨腸，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究得到的最佳工藝[8]（料液比1∶10（m/V），酶解pH 7.1，酶解時(shí)間3 h，酶解溫度25 ℃，酶用量為0.12 U/g）加入粗酶液處理。酶解完畢后，取出鴨腸，用水多次沖洗（3～5 次）后測(cè)定其中膽固醇含量。

純酶組：用純膽固醇氧化酶按照本實(shí)驗(yàn)室前期研究得到的最佳工藝[8]（料液比1∶10（m/V），酶解pH 7.1，酶解時(shí)間3 h，酶解溫度25 ℃，酶用量為0.12 U/g）代替自制粗酶液處理鴨腸，測(cè)定其中膽固醇含量。

空白組：測(cè)定新鮮鴨腸膽固醇含量。

1.3.3 鴨腸中膽固醇含量和膽固醇降解率的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[10-11]提供的方法，稱(chēng)量1 g鴨腸樣品于25 mL具玻塞試管內(nèi)，加入4 mL無(wú)水乙醇，0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%氫氧化鉀溶液，在65 ℃恒溫水浴中皂化l h。皂化完畢后取出試管冷卻。加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%氯化鈉溶液，10 mL石油醚，蓋緊玻塞，振搖2 min，靜置分層。取上層石油醚液2 mL于25 mL具玻塞試管內(nèi)，在65 ℃水浴中將石油醚揮干，加入8 mL冰乙酸，4 mL鐵礬顯色液，混勻，放置30 min后在560 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定吸光度。分別配制0、12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5、100.0 μg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，以吸光度為縱坐標(biāo)，膽固醇質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程為y=1.751 8x－0.020 5 （R2=0.999 5）。在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的膽固醇含量。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。膽固醇含量按照公式（1）計(jì)算，降解率按照公式（2）計(jì)算。

式中：ρ為由吸光度查膽固醇含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到的膽固醇質(zhì)量濃度/（μg/mL)；V1為靜置分層后石油醚的總體積/mL；V2為從石油醚層中吸取的體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g；12為8 mL冰乙酸和4 mL鐵礬顯色液總體積/mL。

式中：C1為降解前鴨腸中膽固醇的含量/（mg/g）；C2為降解后鴨腸中膽固醇的含量/（mg/g）。

1.3.4 粗酶法處理鴨腸的擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)

短桿菌產(chǎn)酶的擴(kuò)大生產(chǎn)：將250 mL的錐形發(fā)酵瓶換為1 000 mL的，其他條件不變，方法同1.3.1節(jié)。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液在4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，所得上清液即為粗酶液，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

粗酶法處理新鮮鴨腸的擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)：剔除新鮮鴨腸表面脂肪，用干紗布吸干表面水分，稱(chēng)取100 g、1 000 g新鮮鴨腸，參照1.3.2節(jié)中粗酶法進(jìn)行酶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定其膽固醇含量，計(jì)算降解率。

1.3.5揮發(fā)性鹽基總氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量的測(cè)定[12-13]

分別稱(chēng)取一定量新鮮鴨腸分別參照1.3.2節(jié)粗酶法、純酶法進(jìn)行酶解，將酶法處理完畢后的新鮮鴨腸用蒸餾水多次沖洗（3～5 次）后，絞碎攪勻，稱(chēng)取約10.0 g置于錐形瓶中，加100 mL水，不時(shí)振搖，浸漬30 min后過(guò)濾，濾液置4 ℃冰箱備用。用未處理的新鮮鴨腸做空白對(duì)照。采用GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》進(jìn)行蒸餾滴定，同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 pH值的測(cè)定

采用GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測(cè)定》的方法[14]，分別稱(chēng)取一定量新鮮鴨腸分別參照1.3.2節(jié)粗酶法、純酶法進(jìn)行酶解，將酶法處理完畢后的新鮮鴨腸洗凈，稱(chēng)取約5.0 g于錐形瓶中，加50 mL水，不時(shí)振搖，浸漬40 min后過(guò)濾，測(cè)定濾液的pH值，同時(shí)用未處理的新鮮鴨腸做空白實(shí)驗(yàn)[15]。

1.3.7 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

選取厚度一致、酶法處理的新鮮鴨腸洗凈，用濾紙吸去表面水分，將鴨腸剪成1 cm×1 cm×1 mm的厚度均勻的薄片，取中間固定部位置于P/0.5探頭下，進(jìn)行測(cè)定后取平均值。同時(shí)用未處理的新鮮鴨腸做空白對(duì)照。參數(shù)設(shè)定[16-18]：測(cè)前速率2 mm/s，測(cè)試速率1 mm/s，測(cè)后速率1 mm/s，兩次壓縮時(shí)間間隔1 s，壓縮比例為80%，探頭選擇為P/0.5，測(cè)定參數(shù)包括硬度、彈性、咀嚼性。

1.3.8 內(nèi)外壁色澤的測(cè)定

選取色澤一致、酶法處理的新鮮鴨腸洗凈，用濾紙吸去表面水分，將鴨腸剪成1 cm×1 cm×1 mm的厚度的均勻薄片，然后分別置于不同編號(hào)的培養(yǎng)皿中待測(cè)其色差，同時(shí)用未處理的新鮮鴨腸做空白對(duì)照。

色澤[19-20]測(cè)定：采用全自動(dòng)色差儀測(cè)定L*、a*、b*值。色差儀首先用標(biāo)準(zhǔn)板校對(duì)，色澤參數(shù)用L*、a*、b*系統(tǒng)測(cè)定。對(duì)腸體進(jìn)行六點(diǎn)檢測(cè)，取平均值。

1.3.9 感官評(píng)定

選取厚度色澤一致，酶法處理的新鮮鴨腸洗凈，然后分別置于不同編號(hào)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行評(píng)定，同時(shí)用未處理的新鮮鴨腸做空白對(duì)照[21]。整個(gè)評(píng)定過(guò)程由10 個(gè)培訓(xùn)過(guò)的感官評(píng)定員進(jìn)行評(píng)定，感官評(píng)定得分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1　鴨腸感官鑒定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of duck intestine

1.4數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次以上的重復(fù)，用Excel軟件計(jì)算其平均值，采用DPS軟件分析顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1酶法降解鴨腸中的膽固醇含量

表2　酶解前后鴨腸中膽固醇含量變化Table 2 Change in cholesterol content in duck intestine before and after degradattiioonn

由表2可知，經(jīng)過(guò)酶法處理后，鴨腸中膽固醇含量均極顯著降低（P＜0.01），其中純酶處理的膽固醇降解效果最好，膽固醇降解率達(dá)到37.18%，而粗酶處理為25.81%。盡管粗酶處理的降解率比純酶處理低近11.37%，但從生產(chǎn)技術(shù)和成本上來(lái)講，粗酶相對(duì)純酶更有優(yōu)勢(shì)，且粗酶可重復(fù)利用，因此有必要進(jìn)一步考察鴨腸經(jīng)粗酶處理后其品質(zhì)的變化。

2.2粗酶法降解鴨腸中膽固醇的擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上研究結(jié)果，采用粗酶法來(lái)擴(kuò)大處理新鮮鴨腸，將鴨腸的單次處理量逐級(jí)擴(kuò)大到100、1 000 g，進(jìn)一步驗(yàn)證粗酶法對(duì)鴨腸膽固醇的降解效果。

表3　粗酶液降解鴨腸中膽固醇的擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 results of ssccale-up experiments for cholesterol content in duck intestine after degradation

由表3可知，擴(kuò)大后用粗酶法處理100、1 000 g組新鮮鴨腸，鴨腸中膽固醇含量極顯著降低（P＜0.01），其膽固醇降解率分別為26.58%、25.34%，與未擴(kuò)大時(shí)的降解率25.81%相比，變化不顯著（P＞0.05），說(shuō)明此方法比較穩(wěn)定，可進(jìn)一步研究其在工業(yè)生產(chǎn)上的運(yùn)用。

2.3酶解前后鴨腸TVBN值和pH值的變化

TVBN值作為評(píng)定肉品的新鮮度常規(guī)指標(biāo)，其值越小肉品越新鮮；肉品肌糖原通過(guò)糖酵解而生成大量乳酸，三磷酸腺苷降解形成磷酸，隨著乳酸和磷酸的不斷積累使得肉品pH值降低；而隨著肉品自身生化反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行乳酸會(huì)降解，使得肉品pH值上升，肉品pH值的變化對(duì)肉色、肉質(zhì)、貨架期等均有顯著影響[22]，因此，TVBN值、pH值是衡量鴨腸品質(zhì)的重要指標(biāo)。

表4　酶解前后鴨腸TVBN值、pH值變化Table 4 Change in TVBN and pH in duck intestine befre and after degradation

由表4可知，與空白組相比，純酶法與粗酶法處理后鴨腸的TVBN值均顯著上升（P＜0.05），但變化幅度較小，不到1 mg/100 g。與空白組相比，純酶法與粗酶法處理后鴨腸的pH值均顯著下降（P＜0.05），變化幅度也較小，不到0.5。三者的TVBN值和pH值均符合DBS 50/002—2011《重慶火鍋鴨（鵝）腸》[13]中規(guī)定的TVBN值≤15 mg/100 g、pH≤8。說(shuō)明粗酶法處理新鮮鴨腸后其新鮮度仍然符合要求。

2.4酶解前后鴨腸質(zhì)構(gòu)特性的變化

硬度（hardness）是指使食品達(dá)到一定變形所需要的力，即食品保持形狀的內(nèi)部結(jié)合力；彈性（springiness）反映了樣品受到外力作用時(shí)變形及去力后的恢復(fù)程度；咀嚼性（chewiness）是一項(xiàng)質(zhì)地綜合評(píng)價(jià)參數(shù)，它是肌肉硬度降低，肌肉細(xì)胞間凝聚力降低，肌肉彈性減小等綜合作用的結(jié)果[23-24]。利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)得酶處理前后鴨腸的部分質(zhì)構(gòu)參數(shù)是判斷鴨腸品質(zhì)變化的重要指標(biāo)。

表5　酶解前后鴨腸質(zhì)構(gòu)特性的變化Table 5 Textural cchanges of duck intestine before and after degradation

由表5可知，經(jīng)酶法處理后的鴨腸與空白組相比，硬度、咀嚼性的變化均不顯著（P＞0.05）；經(jīng)純酶法處理后的鴨腸與粗酶法相比，彈性沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05），但兩者與空白組鴨腸相比，彈性均顯著升高（P＜0.05），可能是因?yàn)槊附膺^(guò)程中pH值下降，鴨腸中結(jié)締組織軟化，僵硬消失，肌肉變得柔軟且富有彈性的結(jié)果[25]。通過(guò)粗酶法處理鴨腸與純酶處理效果相似，都能在一定程度上改善鴨腸的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

2.5酶解前后鴨腸內(nèi)外壁色差的變化

腸壁為4 層結(jié)構(gòu)，即黏膜、黏膜下層、肌層和漿膜，在內(nèi)環(huán)肌層中有橫向穿越的結(jié)締組織間隔帶分布，內(nèi)含有豐富的小血管和神經(jīng)組織。新鮮鴨腸往往呈現(xiàn)暗紅色，主要取決于鴨腸中的肌紅蛋白和血紅蛋白含量[26-27]。由于鴨腸的內(nèi)壁和外壁感官顏色有所差異，故將鴨腸按照內(nèi)外壁分開(kāi)測(cè)定其色澤的變化。

表6　酶解前后鴨腸內(nèi)外壁色差的變化Table 6 Changes in color parameters of inner wall and outer wall of duck intestine before and after degradation

由表6可知，經(jīng)過(guò)酶法處理后的鴨腸內(nèi)、外壁的亮度（L*）值與空白組相比均顯著增大（P＜0.05），但增加幅度不大；與未處理鴨腸內(nèi)、外壁相比，其紅度（a*）值和黃度（b*）值變化不顯著（P＞0.05）；通過(guò)粗酶法處理后的鴨腸與純酶法處理后的相比，鴨腸內(nèi)、外壁的亮度值、紅度值、黃度值均沒(méi)有顯著性的變化（P＞0.05），說(shuō)明通過(guò)粗酶法處理鴨腸與純酶法處理效果相似，都能在一定程度上改善鴨腸的色澤品質(zhì)。

2.6鴨腸感官評(píng)分結(jié)果

表7　酶解前后鴨腸感官評(píng)分Table 7 Sensory analysis of duck intestine before and after degradation

對(duì)不同處理方式的鴨腸進(jìn)行感官評(píng)分，結(jié)果如表7所示。與空白組相比，經(jīng)純酶法與粗酶法處理的新鮮鴨腸，質(zhì)地方面更有彈性，色澤方面白色略增，氣味方面腥味略淡；通過(guò)粗酶法處理后的鴨腸與純酶法處理后的相比，鴨腸的質(zhì)地、色澤、氣味都沒(méi)有顯著性的變化（P＞0.05），說(shuō)明通過(guò)粗酶法處理鴨腸與純酶法處理效果相似，都能在一定程度上改善鴨腸的感官品質(zhì)。

3　結(jié) 論

采用酶法處理新鮮鴨腸可以明顯降低其中膽固醇含量（P＜0.05）；粗酶法處理新鮮鴨腸的擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)測(cè)得膽固醇降解率與未擴(kuò)大階段所得降解率相近（P＞0.05），說(shuō)明此方法比較穩(wěn)定，可進(jìn)一步研究其在工業(yè)生產(chǎn)上的運(yùn)用。

酶法處理后鴨腸的pH值顯著下降，TVBN值顯著上升，但均低于相關(guān)法規(guī)對(duì)鴨腸pH值、TVBN值的上限要求，因此粗酶處理后鴨腸的新鮮度仍然滿(mǎn)足要求。

經(jīng)酶法處理后鴨腸的硬度、咀嚼性以及內(nèi)、外壁紅度值和黃度值變化不顯著（P＞0.05）；而鴨腸的彈性和內(nèi)外壁亮度值顯著增大（P＜0.05）；另外通過(guò)感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)酶法處理后的鴨腸質(zhì)地更有彈性，白色略增，腥味略淡，說(shuō)明通過(guò)粗酶法處理鴨腸與純酶法處理效果相似，都能在一定程度上改善鴨腸的感官品質(zhì)。因此有必要對(duì)如何提高粗酶法處理鴨腸后膽固醇降解率作進(jìn)一步研究。

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Effect of Enzymatic Degradation of Cholesterolon Duck Intestine Quality

DING Shunjie, FU Yu, ZHONG Yushen, DING Xiaowen*

(Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract:Objective: To explore the effect of enzymatic degradation of cholesterol on duck intestine quality. Methods: Crude cholesterol oxidase was prepared in our laboratory and used to degrade cholesterol in duck intestine. Duck intestinal cholesterol was measured by a spectrophotometric method. Duck intestine was subjected to textural profile analysis (TPA) and color difference analysis. Results: After duck intestine was treated by cholesterol oxidase, its cholesterol content was reduced by 25.81% to 26.31 mg/g; TVBN was 13.30 mg/100 g, pH was 6.87, hardness was 10 459.10 g, elasticity was 0.96, chewiness was 6 816.36 g, and the brightness of inner wall and outer wall of duck intestine were 60.52 and 62.23, respectively. Conclusion: The cholesterol oxidase could effectively degrade duck intestinal cholesterol, thereby improving the quality of duck intestine.Key words: duck intestine; cholesterol oxidase; cholesterol; sensory quality

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0143-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507026

*通信作者：丁曉雯（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c功能食品。E-mail：xiaowend@sina.com

作者簡(jiǎn)介：丁順杰（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ?。E-mail：dsjfreedom1990@163.com

基金項(xiàng)目：重慶市科委火鍋菜品現(xiàn)代物流關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化示范項(xiàng)目（CSTC2008AB1019）

收稿日期：2014-06-12