涂宗財，李瑞平，王 輝，黃小琴，常海霞，包中宇，傅志豐

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西 師范大學生命科學學院，江 西 南昌 330022）

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微波預處理對草魚魚肉蛋白消化及其產(chǎn)物抗氧化活性的影響

涂宗財1,2，李瑞平1，王 輝1，黃小琴2，常海霞1，包中宇1，傅志豐1

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西 師范大學生命科學學院，江 西 南昌 330022）

摘 要：草魚魚肉蛋白經(jīng)微波處理后，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步酶解法模擬其在人體胃、腸道的消化過程，以消化率、氨基酸組成、分子質(zhì)量分布及抗氧化活性為指標，研究微波對魚肉蛋白的影響。結果表明：功率800 W時，隨著微波時間的延長，魚肉蛋白消化率逐漸降低，消化產(chǎn)物的疏水性氨基酸及低分子質(zhì)量（≤500 D）組分含量升高；同時，消化產(chǎn)物對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率提高了2.35 倍、2,2-聯(lián)苯-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS＋·）清除率降低了44.77%、還原力提高了6.23 倍。高功率的微波處理會降低魚肉蛋白質(zhì)的可消化性，并影響其消化產(chǎn)物的抗氧化活性。

關鍵詞：草魚魚肉蛋白；微波；消化產(chǎn)物；抗氧化活性

草魚（Ctenopharyngodon idellus），俗名鯇魚，蛋白質(zhì)含量豐富，肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，是我國第一大淡水魚。但因魚體內(nèi)組織酶活躍、易腐敗而在加工應用中受到限制。目前國外對于草魚開發(fā)利用的研究報道較少[1]，而國內(nèi)主要側重于草魚酶解工藝、膠原蛋白提取工藝等的研究；許多蛋白消化酶解產(chǎn)物及其分離出的多肽表現(xiàn)出很好的體外抗氧化活性，如黃色條紋鲹蛋白肽[2]、泥鰍蛋白肽[3]等。未見對草魚魚肉蛋白模擬體外消化及其產(chǎn)物抗氧化活性進行系統(tǒng)研究的報道。因此開展草魚蛋白消化酶解產(chǎn)物抗氧化活性的研究對其在食品中的應用具有重要意義。

微波作為一種新型的加熱技術，因其加熱時間短、速度快；能保持食品的營養(yǎng)成分和風味；熱效率高、節(jié)約能源等特點，被廣泛應用于食品的各領域，如加熱食品、微波輔助水解[4]、微波萃取[5]、微波改性[6]等。研究表明，紅薯和芋頭制品在微波能的作用下溫度迅速升高，導致蛋白酶受熱變性凝固而喪失活性，影響制品的品質(zhì)[7]；微波烹調(diào)魚肉過程中，可溶性蛋白通過二硫鍵構成二聚體或多聚體，出現(xiàn)了兩種高分子質(zhì)量的可溶性蛋白[8]，而微波加熱后魚肉蛋白質(zhì)的消化性及其消化產(chǎn)物的抗氧化活性還不清楚。

本實驗通過微波預處理草魚魚肉蛋白，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步酶解法模擬其在人體胃、腸道的消化過程，研究其消化率、氨基酸組成、分子質(zhì)量分布，并以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、2,2’-聯(lián)苯-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS+·）清除率、還原力為指標考察其抗氧化活性，旨在為草魚和微波在魚制品加工中的應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

草魚，購于當?shù)爻小?/p>

胃蛋白酶（pepsin，≥400 U/mg，EC 3.4.23.1）、胰蛋白酶（pancreatin，P1750-25G，EC 3.4.21.4）、桿菌肽（bacitracin，MW1 422.17 D）、L-氧化型谷胱甘肽（L-glutathione oxidized，MW612.63 D）、L-還原型谷胱甘肽（L-glutathione reduced，MW307.32 D）、馬尿酸（hippuric acid，MW179.17 D）、DPPH 美國Sigma公司；ABTS 美國Sigma-Aldrich公司；鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、十水合四硼酸鈉、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀等均為分析純。

1.2儀器與設備

格蘭仕G80F20CN2L-B8（RO）型微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；Hitachi L-8900氨基酸分析儀、Hitachi D-2000高效液相色譜儀 日本日立公司；UV-3200型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1 草魚魚肉基本組成成分的測定

蛋白質(zhì)含量的測定采用GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；水分含量的測定采用GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》；灰分含量的測定采用GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；脂肪含量的測定采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》。

1.3.2 魚肉的處理

新鮮草魚宰殺后去皮、去骨，取其背部肌肉，去除紅肉，粉碎制成肉泥；置于微波爐中，選取高功率800 W和低功率320 W進行加熱，時間分別為2、4、6、 8、10 min，微波前后樣品凍干、研磨過80目篩，4 ℃保存待用。

1.3.3 消化產(chǎn)物的制備

體外消化采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步消化法[3]，將微波處理的魚肉蛋白配制成40 mg/mL的溶液，用1 mol/L HCl調(diào)pH值至2.0，按酶與底物質(zhì)量比1∶25加入胃蛋白酶，混勻，于37 ℃搖床中消化1 h。胃蛋白酶消化后，先用0.9 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至5.3，再用1 mol/L NaOH 調(diào)pH值至7.5，按酶與底物質(zhì)量比1∶25加入胰蛋白酶，于37 ℃搖床中消化2 h。消化完后，沸水浴10 min滅酶，冰浴冷卻至室溫，5 000×g離心10 min，取上清液凍干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 消化率的測定

參照Adler-Nissen等[9]的方法，利用消化產(chǎn)物中游離氨基的含量來計算消化率[10]。計算公式如下：

式中：C為水解后每1 g蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)/（mmol/g）；Ctot為每1 g原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)/（mmol/g）；N為氮含量/（mg/mL）；6.25為蛋白質(zhì)系數(shù)；0.39為魚肉蛋白中初始—NH2的含量/（mmol/g）；7.6為肉類蛋白質(zhì)的Ctot值/（mmol/g）。

1.3.5 分子質(zhì)量分布的測定[3]

標準曲線的制作：將標準品桿菌肽（1 422.71 D）、L-氧化型谷胱甘肽（612.63 D）、L-還原型谷胱甘肽（307.32 D）、馬尿酸（179.17 D）溶解于流動相中配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，過0.45 μm濾膜。Hitachi D-2000高效液相色譜儀檢測標準品保留時間，參數(shù)設定：流動相：超純水；流動相流速：0.6 mL/min；檢測波長：200 nm，0～25 min；進樣量：10.0 μL；柱溫：35 ℃。以不同分子質(zhì)量標準品的分離保留時間（retention time，RT）與相應的分子質(zhì)量對數(shù)值lnMW繪制標準曲線。

用流動相配制1 mg/mL樣品溶液，5 000×g離心10 min，過0.45 μm的濾膜備用；測定方法同標準品，由標準曲線方程可得樣品分子質(zhì)量分布，再將其分為幾個組段，并求出該分子質(zhì)量組段的相對含量。

1.3.6氨基酸組成的測定[11]

準確稱取0.1 g樣品于安瓿管中，加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，抽真空，維持10 min后，用酒精噴燈封口。110 ℃條件下水解24 h，冷卻后雙層濾紙過濾濃縮，定容至5 mL，過0.45 μm濾膜后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用Hitachi L-8900氨基酸分析儀測定氨基酸組成及各氨基酸含量。

1.3.7 抗氧化活性的測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除率的測定[12]

DPPH溶液的配制：用無水乙醇溶解配制0.2 mmol/L DPPH溶液。配制10 mg/mL樣品溶液，取1.0 mL樣品溶液和3.0 mL DPPH溶液，混合均勻后室溫下暗處反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度。按下式計算DPPH自由基清除率。

式中：Ao為DPPH溶液加樣品溶劑的吸光度；Ai為DPPH溶液加樣品溶液反應后的吸光度；Aj為樣品溶液加DPPH溶液的溶劑的吸光度。

1.3.7.2 ABTS＋·清除率的測定[13]

ABTS溶液的配制：7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶于水中，混勻后避光放置12～16 h，用0.2 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將ABTS溶液稀釋至734 nm波長處吸光度為0.70±0.02。配制10 mg/mL樣品溶液，取20 μL樣品溶液和20 μL蒸餾水與4 mL ABTS溶液混勻，暗處反應10 min后，于734 nm波長處測其吸光度。按下式計算ABTS＋·清除率。

式中：Ao為ABTS溶液加樣品溶劑的吸光度；Ai為ABTS溶液加樣品溶液反應后的吸光度；Aj為樣品溶液加ABTS溶液的溶劑的吸光度。

1.3.7.3還原力的測定[14]

配制10 mg/mL樣品溶液，將0.5 mL樣品溶液、1.5 mL蒸餾水、2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L， pH 6.6）和2.0 mL 1%的鐵氰化鉀溶液先后加入10 mL離心管中混合均勻，50 ℃水浴20 min后加入2.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，5 000×g離心5 min；取上清液2.0 mL， 加入2.0 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，50 ℃水浴10 min，于700 nm波長處測定吸光度。吸光度越高表示樣品還原力越強。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析

。采用Origin7.5軟件作圖，SSPS12.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。

2　結果與分析

2.1草魚魚肉基本組成成分

表1　草魚魚肉基本組成成分的含量Table 1 Basic composition of grass carp meat

魚的種類和生長時間不同，魚肉的基本成分含量也會不同；本實驗選用體質(zhì)量1～1.5 kg的本地草魚作為原料。由表1可知，魚肉水分含量所占比例最大，為82.36%；蛋白質(zhì)含量為13.18%，脂肪含量為3.41%，灰分含量為1.01%。

2.2樣品消化率分析

圖1　微波處理對魚肉蛋白消化率的影響Fig.1 Effect of microwave pretreatment on the digestibility of fish proteins

蛋白質(zhì)在消化過程中，每有一個肽鍵斷裂，就有一個新的－COOH和－NH2形成，因此，可以通過測定消化產(chǎn)物中游離氨基的含量來推算其消化率。由圖1可知，低功率320 W處理魚肉蛋白，其消化率隨處理時間變化不顯著；而高功率800 W處理10 min，其消化率從原樣的（21.77±0.60）%降低到（9.89±0.08）%，降低了54.57%（P＜0.01），說明高功率微波處理的蛋白質(zhì)其消化性顯著降低。這可能是因為微波功率大、時間長使得蛋白質(zhì)聚集變性，胃蛋白酶及胰蛋白酶中蛋白酶的酶解位點被隱藏[15]，使其與蛋白酶的結合變得困難而不容易被消化水解導致游離氨基含量減少，因而消化率降低。竇屾等[16]的研究也表明，高功率長時間微波處理的蛋白質(zhì)其水解度降低。但是并未找到一定微波功率和時間預處理導致魚肉蛋白消化率下降的“拐點”。

2.3消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分析

表2　微波處理對魚肉蛋白消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的影響Table 2 Effect of microwave pretreatment on the molecular weight distribution of digested products from fish proteins

由圖2可知，原樣消化產(chǎn)物（0 W，0 min）的分子質(zhì)量主要集中分布在500～1 000 D（87.4%）；微波處理后，魚肉蛋白消化產(chǎn)物分子質(zhì)量 500～1 000 D組分的相對含量逐漸降低，而低分子質(zhì)量組分（≤500 D）部分顯著增加。微波320 W和800 W處理10 min后，魚肉蛋白消化產(chǎn)物低分子質(zhì)量組分的相對含量由11.84%分別增加到45.24%、47.69%，分別增加了2.82、3.03 倍（P＜0 . 0 1）。這可能是因為蛋白質(zhì)固有頻率（5×1010Hz）恰好處于微波頻率（3×108～3×1011Hz）范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分子在交變電磁場中振動，每個分子的正負電荷都受到交變電場力的作用，造成蛋白質(zhì)空間結構改變；同時當酶用量一定時，微波處理后魚肉蛋白變性，可消化部分減少，酶催化位點與蛋白分子中未變性隱藏的相應位點接觸量增多，從而在一定程度上促進酶作用的酶解效率，使消化產(chǎn)物低分子質(zhì)量組分含量升高[17]。這與王潔昀等[17]研究微波處理后骨膠原蛋白酶解產(chǎn)物小于500 D的分子質(zhì)量組分增加結果一致。此外，Rufián-Henares[18]和Je[19]等的研究表明消化產(chǎn)物中的低分子質(zhì)量（≤500 D）組分具有很好的抗氧化活性。

2.4消化產(chǎn)物氨基酸組成的分析

表3　微波處理后魚肉蛋白消化產(chǎn)物氨基酸組成的分析Table 3 Amino acid composition of digested products from fish proteins subjected to microwave pretreatment

氨基酸的組成對消化產(chǎn)物抗氧化活性具有重要作用[20]，酪氨酸、蛋氨酸、組氨酸、賴氨酸等氨基酸具有抗氧化活性[21]。由表3可知，與原樣（0 W，0 min）相比，微波處理后魚肉蛋白消化產(chǎn)物各氨基酸含量百分比有了明顯變化，其中具有抗氧化活性氨基酸的含量分別為19.27%（未處理組）、22.98%（320 W）、18.29%（800 W）；疏水性氨基酸含量分別為38.18%（未處理組）、38.82% （320 W）、44.87%（800 W），呈現(xiàn)逐漸升高趨勢（P＜0.05）。這說明微波處理能增加疏水性氨基酸含量，可能是因為微波處理使蛋白變性的同時導致更多的疏水性氨基酸殘基暴露[22]，消化酶更易與其接觸，因而消化產(chǎn)物中疏水性氨基酸含量增加。

2.5消化產(chǎn)物的抗氧化活性

2.5.1 消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率

DPPH自由基在有機溶劑中是一種比較穩(wěn)定的自由基，其在517 nm波長處有最大吸收。目前將DPPH自由基清除率作為考察抗氧化活性的重要指標之一，清除率越大，抗氧化活性越強。

圖2　微波處理對魚肉蛋白消化產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of microwave pretreatment on the DPPH radical scavenging activity of digested products from fish proteins

由圖2可知，低功率320 W處理不同時間魚肉蛋白消化產(chǎn)物DPPH自由基清除率變化不大。高功率800 W隨著處理時間的延長，魚肉蛋白消化產(chǎn)物DPPH自由基清除率逐漸提高，從（7.38±0.44）%提高到（24.7±0.53）%，提高了2.35 倍（P＜0.01）。說明高功率微波處理可以提高樣品消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。這可能是因為隨著微波時間的延長，樣品中更多的疏水性基團暴露[23]，消化液疏水性增強，使其更易與脂溶性的DPPH自由基反應，從而使DPPH自由基清除率得以提高。

2.5.2 消化產(chǎn)物的ABTS＋·清除率

圖3　微波處理對魚肉蛋白消化產(chǎn)物ABTS＋·清除率的影響Fig.3 Effect of microwave pretreatment on the ABTS+· scavenging activity of digested products from fish proteins

ABTS易被過硫酸鉀氧化成ABTS＋·，ABTS＋·是一種穩(wěn)定的自由基，當加入抗氧化試劑后，ABTS＋·被還原成ABTS，從而在最大吸收峰處的吸光度會產(chǎn)生相應的變化。由圖3可知，低功率320 W處理不同時間魚肉蛋白消化產(chǎn)物ABTS＋·清除率變化不明顯；高功率800 W隨著處理時間的延長，魚肉蛋白消化產(chǎn)物ABTS＋·清除率逐漸降低，從（57.05±1.89）%降低到（31.51±1.15）%，降低了44.77%（P＜0.01）。ABTS＋·清除率的變化趨勢與DPPH自由基清除率相比有所不同，這可能是因為ABTS＋·為水溶性，高功率800 W微波魚肉蛋白隨著加熱時間延長，蛋白質(zhì)迅速變性，消化率降低，導致消化水解生成的水溶性物質(zhì)減少所致。由數(shù)據(jù)可知，盡管微波800 W 10 min處理魚肉蛋白其消化產(chǎn)物的ABTS＋·清除率有所降低，但是仍然比DPPH自由基清除率最高時的（24.7±0.53）%要高。這可能是因為經(jīng)過胃蛋白酶-胰蛋白酶消化后，其消化產(chǎn)物中積累了大量的小分子肽[23]，親水性增強的緣故。

2.5.3 消化產(chǎn)物的還原力

圖4　微波處理對魚肉蛋白消化產(chǎn)物還原力的影響Fig.4 Effect of microwave pretreatment on the reducing power of digested products from fish proteins

還原力與抗氧化活性在一定程度上存在緊密聯(lián)系，還原力越強，表明抗氧化活性越好[24]。由圖4可知，低功率320 W處理不同時間魚肉蛋白消化產(chǎn)物的還原力呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，但總體上變化不大。高功率800 W隨著處理時間的延長，魚肉蛋白消化產(chǎn)物的還原力逐漸升高，從（0.13±0.01）升高到（0.94±0.04），提高了6.23 倍（P＜0.01）。這可能是因為消化產(chǎn)物中的低分子質(zhì)量多肽組分是很好的氫或電子供應體[23]，所以還原力是逐漸增強的。

3　結 論

高功率長時間的微波處理會使草魚魚肉蛋白的可消化性降低，消化產(chǎn)物中低分子質(zhì)量（≤500 D）組分和疏水性氨基酸含量升高。微波處理對魚肉蛋白消化產(chǎn)物的抗氧化活性產(chǎn)生影響，其中800 W微波處理使DPPH自由基清除能力升高、ABTS＋·清除能力降低、還原力增強。因此，研究微波魚肉蛋白的可消化性及其消化產(chǎn)物的相關性質(zhì)可以為草魚和微波在魚制品加工中的應用提供一定的理論基礎。

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Effect of Microwave Pretreatment on the Digestibility of Grass Carp (Ctenopharyngodon idellus) Protein and Its Antioxidant Activity

TU Zongcai1,2, LI Ruiping1, WANG Hui1, HUANG Xiaoqin2, CHANG Haixia1, BAO Zhongyu1, FU Zhifeng1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Life Science, Jiangxi Normal Univers ity, Nanchang 330022, China)

Abstract:Grass carp (Ctenopharyngodon idellus) proteins were hydrolyzed sequentially by pepsin and pancreatin in an in vitro digestion model system after microwave pretreatment. The degree of hydrolysis, amino acid composition, molecular weight distribution and antioxidant activity were studied. The results demonstrated that the degree of hydrolysis was significantly decreased at 800 W microwave power with an increase in microwave treatment time. Accordingly, we observed an increase in the contents of hydrophobic amino acids and short chain peptides with molecular weight lower than 500 D. Enzymatic breakdown in the simulated gastrointestinal environment caused a 3.35-fold increase in DPPH radical scavenging activity and a 7.23-fold increase in reducing power but a 44.77% reduction in 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS+·) scavenging activity compared to the blank samples. In conclusion, high microwave power can decrease the digestibility of the proteins and affectthe antioxidant activity of the digested products.

Key words:grass carp (Ctenopharyngodon idellus) protein; microwave; hydrolysate; antioxidant activity

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507011

中圖分類號：TS254.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0056-05

作者簡介：涂宗財（1965—），男，教授，博士，研究方向為食物資源開發(fā)與高效利用。E-mail：tuzc_mail@aliyun.com

基金項目：江西省重大科技 創(chuàng)新研究項目（20124ACB00600）；江西省大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術體系項目（JXARS-02）

收稿日期：2014-06-30