劉丹花,張艷俠

(1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院,河南鄭州451150;2.國(guó)際眼科雜志社,陜西西安710054)

PGE1預(yù)處理對(duì)缺血再灌注心肌NF-κB及ICAM-1表達(dá)的影響

劉丹花1,張艷俠2

(1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院,河南鄭州451150;2.國(guó)際眼科雜志社,陜西西安710054)

摘 要:目的探討PGE1預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷心肌NF-κB和ICAM-1表達(dá)的影響,進(jìn)一步從炎癥信號(hào)通路揭示PGE1對(duì)MIRI保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法40只大鼠隨機(jī)分為5組∶正常對(duì)照組、缺血再灌注組(I/R組)、PGE114μg/L預(yù)處理組、PGE142μg/L預(yù)處理組和PGE1126μg/L預(yù)處理組。采用Langendorff大鼠離體心臟灌流裝置制備MIRI模型,制備病理切片觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的變化,免疫組化法測(cè)定NF-κB及ICAM-1的表達(dá)。結(jié)果PGE1各劑量預(yù)處理組大鼠缺血再灌注心肌組織形態(tài)學(xué)變化得到不同程度的改善;NF-κB及ICAM-1的表達(dá)在各PGE1預(yù)處理組較I/R組明顯減少,且各組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。結(jié)論P(yáng)GE1預(yù)處理可以改善大鼠缺血再灌注心肌組織形態(tài)學(xué)變化,并通過(guò)抑制NF-κB和ICAM-1的表達(dá)減輕心肌中PMN介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),有效減輕離體大鼠MIRI。

關(guān)鍵詞:前列腺素E1;缺血再灌注損傷;核因子-B;細(xì)胞間黏附分子-1;離體心臟

近年來(lái),隨著心肌梗死后溶栓治療、PTCA等心臟介入性治療的廣泛開(kāi)展,為縮小心肌梗死面積、改善患者臨床癥狀起到了良好的效果。然而由此帶來(lái)的心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injuryz,MIRI)成為影響手術(shù)效果及病人預(yù)后的關(guān)鍵因素,如何減輕MIRI成為亟待解決的問(wèn)題。PGE1具有擴(kuò)張外周和冠脈血管、抑制血小板聚集、減輕炎癥反應(yīng)等作用。以往的研究[1-3]已從多方面證實(shí)PGE1具有保護(hù)缺血再灌注心肌的作用,然而對(duì)于PGE1預(yù)處理在離體大鼠MIRI中NF-κB和ICAM-1的表達(dá)所介導(dǎo)的炎癥損傷以及NF-κB和ICAM-1之間的聯(lián)系,尚未見(jiàn)報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察NF-κB和ICAM-1在缺血再灌注心肌中的表達(dá)規(guī)律,進(jìn)一步探討PGE1預(yù)處理對(duì)大鼠離體心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1　材料與方法

復(fù)。體積分?jǐn)?shù)為3%H2O2溶液中室溫孵育,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。切片上滴加山羊血清封閉液,封閉抗原。一抗?jié)窈袃?nèi)孵育,4℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗液,室溫孵育15 min,滴加辣根化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,室溫孵育15 min。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察切片, DAB染色棕色顆粒為陽(yáng)性產(chǎn)物。應(yīng)用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,測(cè)量陽(yáng)性信號(hào)灰度值,以陽(yáng)性信號(hào)灰度值作為NF-κB及ICAM-1表達(dá)的測(cè)定指標(biāo)。

1.3數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,所有資料采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),單因素方差分析,組間用LSD法進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)結(jié)果均取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

1.1材料

成年健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量300～350 g(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);前列腺素E1粉針劑(南陽(yáng)普康藥業(yè)有限公司,規(guī)格20 g/支);SP免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗NF-κBp65抗體、兔抗ICAM-1抗體。(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 40只SD大鼠隨機(jī)分為五組:正常對(duì)照組、缺血再灌注組、PGE1小、中、大劑量(14、42、126μg/L)預(yù)處理組,每組8只。

1.2.2大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的制備 大鼠稱(chēng)重,腹腔注射20%烏拉坦(0.5 m L/100 g)進(jìn)行麻醉,肝素500 U抗凝。迅速開(kāi)胸取出心臟,立即放入4℃預(yù)冷無(wú)鈣臺(tái)式液中,經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管并結(jié)扎,迅速移至Langendorff灌流裝置上,灌流約15 min,待心率大于200次/min,繼續(xù)灌流正常臺(tái)式液或含PGE1的正常臺(tái)式液30 min,然后停灌,保持心臟溫度恒定在37℃,在無(wú)氧無(wú)灌流液的條件下曠置30 min,再用正常臺(tái)式液恢復(fù)灌流2 h。灌流結(jié)束后取下心臟,取左心室前壁同一部位心肌組織,用體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛固定,石蠟包埋,切片,常規(guī)HE染色。

1.2.3大鼠心肌組織中NF-κB和ICAM-1的測(cè)定各組心肌用體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,做4μm厚切片,烤片。切片常規(guī)二甲苯脫蠟,乙醇水化后,放入檸檬酸鈉緩沖液中,進(jìn)行抗原修

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的變化

光鏡下觀察,正常對(duì)照組心肌組織形態(tài)學(xué)未見(jiàn)異常改變,肌纖維完整,染色均勻,排列緊密,橫紋清晰,間質(zhì)未見(jiàn)血管擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);缺血再灌注組大范圍心肌纖維腫脹、斷裂、壞死融合,染色不均勻,排列不規(guī)則,橫紋消失,間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);PGE1小劑量(14μg/L)預(yù)處理組較大范圍心肌纖維斷裂、腫脹,排列紊亂,部分橫紋消失,間質(zhì)有血管擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但程度較缺血再灌注組有所減輕;PGE1中劑量(42μg/L)預(yù)處理組心肌纖維腫脹,但少有斷裂,間質(zhì)血管擴(kuò)張不明顯,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);PGE1大劑量(126μg/L)預(yù)處理組少許心肌纖維腫脹,無(wú)斷裂,間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)血管擴(kuò)張,偶有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),形態(tài)學(xué)近似于正常對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

2.2免疫組化染色法測(cè)定各組大鼠心肌組織中NF-κB及ICAM-1的表達(dá)

各實(shí)驗(yàn)組心肌組織均有NF-κB和ICAM-1表達(dá)。正常對(duì)照組心肌NF-κB和ICAM-1只有少量表達(dá),缺血再灌注組心肌NF-κB和ICAM-1的陽(yáng)性表達(dá)最明顯(P＜0.05),PGE1各劑量預(yù)處理組NF-κB和ICAM-1的陽(yáng)性表達(dá)較缺血再灌注組明顯減少(P＜0.05),且PGE1各劑量預(yù)處理組之間兩兩比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

3　討論

心肌缺血預(yù)處理是通過(guò)一次或數(shù)次短暫的重復(fù)缺血/再灌注來(lái)提高心肌對(duì)隨后可能發(fā)生的心肌缺血再灌注損傷的耐受性,減輕MIRI。自從1986年Murry等[4]首次提出這一概念以來(lái),關(guān)于它的保護(hù)條件及其機(jī)制的探索日益成為心血管疾病防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨著對(duì)心肌缺血預(yù)處理認(rèn)識(shí)的不斷加深,通過(guò)藥物誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性活性物質(zhì)的合成和釋放,模擬心肌缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用,即藥理性預(yù)適應(yīng)已成為心肌缺血損傷防治研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

核因子-B(Nuclear transcription factor-B, NF-κB)是1986年由Sen等[5]從B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白κB輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異性結(jié)合,并能促進(jìn)κB輕鏈轉(zhuǎn)錄的因子。它是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,在組織細(xì)胞中廣泛存在,可調(diào)控包括IL-1、IL-6、ICAM-1等多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄,從而在免疫、炎癥、細(xì)胞的凋亡等方面起到重要的作用。近年來(lái)的大量研究發(fā)現(xiàn),NF-κB與心肌缺血再灌注有著密切關(guān)系。心肌缺血再灌注后引起的氧化應(yīng)激、復(fù)氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子超載、游離基、NO、內(nèi)毒素等能激活NF-κB,由此導(dǎo)致心肌的各種病理改變。

細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)廣泛表達(dá)于成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。正常情況下,內(nèi)皮細(xì)胞僅表達(dá)少量的ICAM-1,但在多種炎癥因子、高血壓、缺血再灌注等因素刺激下其表達(dá)量可增加。中性粒細(xì)胞的激活、黏附、聚集、脫顆粒是MIRI的重要病理過(guò)程,再灌注過(guò)程中,大量活化的中性粒細(xì)胞黏附在心肌微血管內(nèi)并浸潤(rùn)到心肌組織中,通過(guò)釋放細(xì)胞炎性物質(zhì)、氧自由基、蛋白酶等物質(zhì)引起心肌損傷[6]。在介導(dǎo)PMN與內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞黏附的過(guò)程中, ICAM-1起重要作用。由此可見(jiàn),心肌缺血再灌注激活NF-κB后,可促進(jìn)編碼ICAM-1基因的轉(zhuǎn)錄, ICAM-1表達(dá)增加,進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn),加重心肌炎癥損傷。

目前,諸多的研究已經(jīng)證實(shí)降低NF-κB的激活、下調(diào)NF-κB依賴(lài)的炎癥介質(zhì)ICAM-1的表達(dá)在抗心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制中起重要作用。何泉等[7]的研究發(fā)現(xiàn),在大鼠心肌缺血前靜脈注射PDTC可以顯著減小急性心肌梗死再灌注后無(wú)再流范圍,其作用與抑制再灌注后缺血區(qū)ICAM-1及P-選擇素的表達(dá)有關(guān)。張慧芝等[8]研究大鼠心肌缺血30 min,再灌注2 h時(shí)NF-κB和ICAM-1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注組兩者的表達(dá)量最高,而缺血前用芹菜素預(yù)處理心臟后,兩者的表達(dá)量較缺血再灌注組顯著減少,與此同時(shí),心肌缺血缺氧程度減輕,說(shuō)明抑制NF-κB的活性,降低IRI后炎癥因子ICAM-1的表達(dá)可能是芹菜素保護(hù)心肌IRI的重要機(jī)制。

我們的研究結(jié)果顯示,心肌缺血再灌注組NF-κB及ICAM-1的表達(dá)量在各組中最高,光鏡下觀察大鼠心肌可見(jiàn)大范圍心肌纖維斷裂、腫脹、壞死融合,細(xì)胞排列不規(guī)則,結(jié)構(gòu)紊亂,間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而PGE1各劑量預(yù)處理組NF-κB及ICAM-1的表達(dá)量明顯減少,光鏡下觀察其心肌纖維形態(tài)學(xué)改變明顯改善,說(shuō)明PGE1預(yù)處理可以減輕MIRI。其機(jī)制可能是PGE1通過(guò)抑制心肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化,進(jìn)而減少由NF-κB調(diào)控的炎癥因子ICAM-1的表達(dá),減少中性粒細(xì)胞在缺血區(qū)的黏附、聚集、脫顆粒,改善缺血區(qū)組織水腫、出血、壞死及其他病理改變,保護(hù)缺血再灌注心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能。

參考文獻(xiàn):鼠心肌細(xì)胞凋亡及bcl-1、bax蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥房,2007,18(16):1 217―1 219.

[2]角燦武,付潤(rùn)芳.前列腺素E1藥理性預(yù)適應(yīng)對(duì)缺血-再灌注豚鼠心室肌細(xì)胞ATP敏感性鉀通道的影響[J].中國(guó)藥理通訊,2009,26(2):38.

[3]張艷俠,劉丹花,角燦武,等.前列腺素E1預(yù)處理對(duì)缺血/再灌注心肌PKC及HSP70表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011,27(3):402―405.

[4]Murry C E,Jennings R B,Reimer K A.Preconditioning with ischemia:A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74(5):1 124―1 136.

[5]Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences[J].Cell,1986,46 (5):705―716.

[6]Lefer A M,Camplell B,Skin Y K,et al.Simvastatin preserves the ischemia reperfusion myocardium in nomocholesterolemic rat hearts[J].Circulation,1999,100(2): 178―184.

[7]何泉,雷寒,柳青,等.NF-κB抑制劑對(duì)大鼠AMI再灌注后無(wú)再流及ICAM-1,P-選擇素表達(dá)的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(17):1 545―1 548.

[8]張慧芝,白建平,于肯明.芹菜素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌核轉(zhuǎn)錄因子-B和ICAM-1表達(dá)的影響[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2010,19(2):181―184.

[責(zé)任編輯姬 荷]

[1]馬香芹,付潤(rùn)芳,宋麗杰,等.前列腺素E1對(duì)缺氧復(fù)氧乳

Effects of Prostaglandin E1on NF-κB and ICAM-1 expression in preconditioning myocardium with ischemia/reperfusion

LIU Danhua1，ZHANG Yanxia2
（1.Zhengzhou University of Industrial Technology，Zhengzhou 451150，China；2.The Press of International Journal of Ophthalmology，Xi'an 710054，China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of NF-κB and ICAM-1 expression in preconditioning myocardium with ischemia reperfusion injury and reveal the possible mechanism of PGE1protective effect from inflammatory signaling pathways.Methods40 rats were divided into five groups at random:normal control group，ischemia/ reperfusion group and PGE114，42，126μg/L preconditioning groups.The model of myocardial ischemia reperfusion injury was established in isolated rat heart perfused with Langendorff technique，the pathological slices were maked to observe the pathomorphological changes of the rat myocardial fibers，the immunohistochemical method was used to measure the changes of NF-κB and ICAM-1 expression.ResultsThe morphological changes of ischemia/reperfusion myocardial fiber were improved in PGE1 preconditioning groups.Compared with the I/R group，the myocardial expression of NF-κB and ICAM-1 in PGE1preconditioning group was significantly reduced（P＜0.05）.ConclusionPGE1preconditioning can improve the morphological changes of ischemia/reperfusion myocardial fibre，inhibit the expression of NF-κB and ICAM-1 in order to effectively reduce the myocardial inflammation mediated PMN and reduce ischemia/reperfusion injury in isolated rat heart.

Key words：Prostaglandin E1；ischemia reperfusion injury；nuclear transcription factor-B；Intercellular adnesion molecule-1；isolated heart

作者簡(jiǎn)介:劉丹花(1985―),女,河南新鄉(xiāng)人,講師,從事藥理學(xué)的教學(xué)和研究工作。

收稿日期:2015-01-20

中圖分類(lèi)號(hào):R965

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1672―7606(2015)02―0115―04