仲念念,朱伶俐,王 旋,房 娜

(1.河南大學醫(yī)學院,河南開封475004;2.南京大學生命科學學院,江蘇南京210046)

TAZ基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達

仲念念1,朱伶俐2,王 旋1,房 娜1

(1.河南大學醫(yī)學院,河南開封475004;2.南京大學生命科學學院,江蘇南京210046)

摘 要:目的構(gòu)建重組質(zhì)粒TAZ-pcDNA3.1及TAZ-p EGFP-C2,并應用Western Blot檢測TAZ蛋白在細胞內(nèi)的表達情況,初步探索TAZ分子促進細胞增殖和遷移的作用機制。方法通過PCR擴增獲得TAZ基因片段,膠回收后連接T載體,藍白斑篩選,轉(zhuǎn)化,提質(zhì)粒,酶切,用T4 DNA Ligase連接,亞克隆進入pEGFP-C2和pcDNA3.1獲得新的重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞,智能型熒光細胞監(jiān)測儀觀察TAZ分子在細胞內(nèi)的分布情況,Western Blot檢測其在細胞內(nèi)的表達情況。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定和測序證明構(gòu)建成功,熒光照片顯示TAZ分子分布在細胞核和細胞漿中,Western Blot檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染有重組質(zhì)粒TAZ-pcDNA3.1的HEK293細胞中有大量TAZ蛋白表達。結(jié)論成功構(gòu)建了兩種重組質(zhì)粒,并初步驗證了TAZ蛋白的細胞定位,為進一步研究其促進增殖和遷移的作用機制奠定了基礎。

關鍵詞:TAZ基因;重組質(zhì)粒;HEK293細胞

Hippo信號轉(zhuǎn)導通路在調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡中具有重要作用,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關系[1]。TAZ分子是轉(zhuǎn)錄共激活因子,是Hippo信號通路中的一個靶點,作為14-3-3蛋白的結(jié)合蛋白發(fā)揮作用,因為它有著WW結(jié)構(gòu)域,也被稱為WWTR1[2]。在癌細胞中,TAZ分子的表達量很高,如人乳腺癌細胞系、胃癌細胞、非小細胞肺癌等,其過表達引起的形態(tài)學改變細胞轉(zhuǎn)化的特性,促進細胞的增殖、遷移和侵襲[3]。TAZ分子在不同的細胞中的分布不同,有的分布在細胞漿中如原發(fā)性乳腺導管癌細胞,有的分布在細胞核中如骨轉(zhuǎn)移瘤細胞[4-5]。因此,明確TAZ蛋白的亞細胞定位有助于闡明其促進增殖和遷移的作用機制。本實驗構(gòu)建了重組質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2及TAZ-pcDNA3.1,并初步檢測了TAZ蛋白的表達情況和細胞定位,為進一步闡明TAZ蛋白促進增殖和遷移的作用機制奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1細胞、質(zhì)粒載體和菌株

HEK293細胞由河南大學醫(yī)學院細胞與免疫實驗室惠贈;含TAZ基因的質(zhì)粒PET28a-TAZ(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);質(zhì)粒pcDNA3.1和p EGFP-C2以及感受態(tài)大腸桿菌TOP10為本實驗室保存。

1.2主要試劑與儀器

內(nèi)切酶EcoRⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA Ligase、LA Taq聚合酶、T載體連接試劑盒(日本Ta KaRa公司);質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker(上海萊楓生物科技有限公司);Lipo2000(美國Invitrogen公司);兔抗人TAZ多抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);HRP標記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司);PCR擴增儀、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);WD-9413B紫外凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠);Ju LI智能型熒光細胞監(jiān)測儀(韓國NanoEn Tek公司)。

1.3引物設計與PCR產(chǎn)物擴增

根據(jù)GeneBank中TAZ的基因序列(Gene ID: 25937)設計引物:T1:5'-GAATTCATGAATCCGGCCTCGGCGCCCC-3',5'端引入ECORⅠ酶切位點; T2:5'-GGATCCTTACAGCCAGGTTAGAAAGGGC-3', 5'端引入Bam HⅠ酶切位點。引物由蘇州金唯智生物工程公司合成。以質(zhì)粒PET28a-TAZ為模板,通過PCR擴增獲得目的片段。PCR的反應條件為: 94℃預變性5 min;30個循環(huán)擴增:94℃(45 s),58℃(45 s),72℃(90 s);循環(huán)結(jié)束后,72℃延伸5 min,16℃降溫10 min。取PCR反應液5μL,10 g/ L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4構(gòu)建重組質(zhì)粒

將目的片段與T載體16℃水循環(huán)連接過夜,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)TOP10細胞,鋪板,藍白篩選,挑取白色單克隆菌落,37℃搖菌過夜,提質(zhì)粒,用EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切鑒定,并送上海生工生物工程有限公司測序。將測序正確的TAZ-T載體質(zhì)粒和質(zhì)粒pc DNA3.1及p EGFP-C2分別用EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切,電泳,膠回收目的片段。將回收的TAZ片段分別和回收的pcDNA3.1及p EGFP-C2酶切片段16℃水循環(huán)連接過夜,轉(zhuǎn)化,挑陽性克隆,搖菌,提質(zhì)粒并用Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切鑒定,將鑒定正確的重組質(zhì)粒―20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5觀察TAZ分子細胞定位

參考轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000的使用說明書進行操作,用Lipo2000將新鮮提取的重組質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2轉(zhuǎn)入70%融合的HEK293細胞中,培養(yǎng)36 h后用熒光細胞監(jiān)測儀觀察重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率及TAZ分子在細胞內(nèi)的分布情況。

1.6檢測TAZ蛋白表達水平

用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000分別將新鮮提取的重組質(zhì)粒TAZ-pcDNA3.1和質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)入80%融合的HEK293細胞中,并設置無轉(zhuǎn)染試劑的空白對照和只加入轉(zhuǎn)染試劑的陰性對照。培養(yǎng)48 h后分別收集細胞,提蛋白,體積分數(shù)為10%SDS-PAGE電泳, PVDF膜轉(zhuǎn)印,用50 g/L的奶粉按1∶750的比例稀釋TAZ抗體,4℃搖床孵育過夜。按1∶10 000的比例稀釋二抗(羊抗兔抗體),室溫孵育1 h,在膜上滴ECL發(fā)光液,暗室中壓片曝光。

2　結(jié)果

2.1PCR擴增產(chǎn)物

PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳可觀察到在1 000 bp和2 000 bp之間有特異性條帶,大小與TAZ基因相符(1 400 bp),見圖1。

2.2重組質(zhì)粒酶切鑒定

TAZ連接T載體經(jīng)藍白篩選,挑取白色單克隆菌落搖菌后送去測序,測序結(jié)果正確。TAZ-p EGFPC2和TAZ-pcDNA3.1酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果為兩條帶,一條帶約為1 400 bp,一條約為5 000 bp,符合預期結(jié)果。見圖2。由此結(jié)果表明重組質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2和TAZ-pcDNA3.1構(gòu)建成功。

2.3TAZ分子細胞定位觀察

重組質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2轉(zhuǎn)染HEK293細胞48 h后,用熒光細胞監(jiān)測儀觀察綠色熒光。TAZ蛋白彌散分布于細胞質(zhì)與細胞核中,細胞核中更為集中。見圖3。

2.4TAZ分子蛋白表達水平

Western Blot檢測TAZ表達情況結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出TAZ抗體檢測結(jié)果為轉(zhuǎn)染TAZ-pc DNA3.1的細胞蛋白表達量明顯多于轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1和未轉(zhuǎn)染的細胞表達量。

3　討論

Hippo信號轉(zhuǎn)導通路可以調(diào)控細胞內(nèi)環(huán)境,其調(diào)控作用失調(diào)時就會引起癌癥的發(fā)生,而TAZ分子是此通路中一個重要調(diào)控靶點,其促進細胞增殖和遷移的機制需要進一步探究[6]。

TAZ是一個轉(zhuǎn)錄共激活因子,進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子活性促進基因表達[2]。實時監(jiān)測TAZ的亞細胞定位是研究TAZ分子促進細胞增殖和遷移機制的一個重要的實驗手段。我們的實驗所采用的p EGFP-C2載體,其加強型的GFP標記在所表達蛋白的N端,這樣即可以方便檢測帶有EGFP標簽的目的蛋白,與轉(zhuǎn)染細胞自身表達或誘導表達的TAZ蛋白進行區(qū)別,而且不需要處理轉(zhuǎn)染細胞,可以直接在熒光顯微鏡下觀察標簽蛋白的亞細胞定位。

我們成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2和TAZ-pcDNA3.1。在今后的研究中,運用該真核表達質(zhì)粒不僅可以直接采用熒光顯微鏡探討影響TAZ亞細胞定位的因素,也能用Western Blot法檢測TAZ的蛋白表達水平,為探討TAZ分子促進細胞增殖和遷移的機制提供了實驗材料。

參考文獻:new look at a key pathway in cell growth and transformation[J].Cell Cycle,2010,9(12):2 292―2 299.

[2]Ferrara A M,De Sanctis L,Rossi G,et al.Mutations in TAZ/WWTR1,a co-activator of NKX2.1 and PAX8 are not a frequent cause of thyroid dysgenesis[J].J Endocrinol Invest,2009,32(3):238―241.

[3]Guo L,Teng L.YAP/TAZ for cancer therapy:Opportunities and challenges(Review)[J].Int J Oncol,2015,46 (4):1 444―1 452.

[4]Shi P,Feng J,Chen C.Hippo pathway in mammary gland development and breast cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2015,47(1):53―59.

[5]Vici P,Mottolese M,Pizzuti L,et al.The Hippo transdu cer TAZ as a biomarker of pathological complete response in HER2-positive breast cancer patients treated with trastuzumab-based neoadjuvant therapy[J].Oncotarget, 2014,5(20):9 619―9 625.

[6]Mc Neill H,Sudol M,Halder G,et al.The Hippo tumor suppressor pathway:a report on the Second Workshop On The Hippo tumor suppressor pathway'[J].Cell Death Differ,2011,18(8):1 388―1 390.

[責任編輯姬 荷]

[1]Fernandez L A,Kenney A M.The Hippo in the room:a

Construction and expression of recombinant plasmid TAZ-pcDNA3.1 and TAZ-pEGFP-C2

ZHONG Niannian1，ZHU Lingli2，WANG Xuan1，F(xiàn)ANG Na1
（1.Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.College of Life Science of Nanjing University，Nanjing 210046，China）

Abstract：ObjectiveTwo recombinant plasmids，TAZ-pcDNA3.1 and TAZ-p EGFP-C2，were established.The protein expression of TAZ in HEK293 cells was detected by Western Blot and the roles of TAZ in promoting cell proliferation and migration were further explored.MethodsAZ gene was amplified by PCR，fragments were recovered followed by connection with glue T carrier，blue-white screening，transformation and extraction of plasmid DNA.Then the plasmid DNA was digested，connected by T4 DNA Ligase，and then sub-cloned into p EGFP-C2 and pcDNA3.1 to construct new recombinant plasmids.These plasmids were transfected into HEK293 cells to observe the distribution of TAZ using a fluorescence detector.The protein expression was detected by Western Blot.ResultsBy restriction enzyme identification and sequence analysis，the recombinant plasmids were successfully constructed.Fluorescent photos show that the distribution of TAZ molecule was in the nucleus and cytoplasm.Western Blot test results showed that TAZ molecule could induce over-expression of specific proteins.ConclusionTwo recombinant plasmids were successfully constructed.The effects of TAZ over-expression were validated，which will lay a foundation for revealing the mechanism of TAZ in promoting cell proliferation and migration.

Key words：TAZ gene；The recombinant plasmid；HEK293 cells

作者簡介:仲念念(1995―),男,河南駐馬店人,在校本科生,從事基礎及口腔醫(yī)學的學習與研究工作。

基金項目:河南大學校內(nèi)科研基金(2011YBZR007)。

收稿日期:2015-03-01

中圖分類號:Q786

文獻標識碼:A

文章編號:1672―7606(2015)02―0111―04