王金梅,陳 龍,朱曉娣,連朋麗

(河南大學(xué)中藥研究所,河南開(kāi)封475004)

錦雞兒生物活性研究

王金梅,陳 龍,朱曉娣,連朋麗

(河南大學(xué)中藥研究所,河南開(kāi)封475004)

摘 要:目的考察錦雞兒生物活性。方法采用清除DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP法對(duì)錦雞兒體外總抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),并同時(shí)測(cè)定了體外α-葡萄糖苷酶抑制活性和體外抗凝血活性。結(jié)果錦雞兒具有一定的體外抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性和體外抗凝血活性,其中以乙酸乙酯部位抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性最強(qiáng)。結(jié)論錦雞兒具有潛在的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性。

關(guān)鍵詞:錦雞兒;地上部分;抗氧化;體外α-葡萄糖苷酶抑制活性;體外抗凝血活性

錦雞兒(Caragana sinica(Buchoz.)Rehd.)為豆科(Leguminesae)錦雞兒屬植物,常以根和花入藥,其根又名金雀花根、白心皮等,民間常用于治療虛損、勞熱咳嗽、高血壓、婦科疾患、關(guān)節(jié)炎等;花稱金雀花,用于頭暈頭痛、耳鳴眼花、肺虛久咳、小兒疳積[1]。目前從錦雞兒屬植物中分離得到的化合物類型包括黃酮、二苯乙烯低聚體類、苯丙素、香豆素、萜類和甾體等;本屬植物的藥理活性主要集中在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)錦雞兒本植物的研究較少,據(jù)報(bào)道,從錦雞兒的根中分離得到的化合物為二苯乙烯苷低聚體和異黃酮類化合物,生物活性主要集中在抗炎、提高免疫力及刺激成骨細(xì)胞增殖的活性[3],未見(jiàn)有對(duì)錦雞兒地上部分的體外抗氧化活性、體外α-葡萄糖苷酶抑制活性、體外抗凝血活性的報(bào)道。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)錦雞兒藥用資源,我們對(duì)錦雞兒地上部分進(jìn)行了系統(tǒng)的生物活性研究。

1　儀器、材料與試劑

1.1儀器

電子天平(美國(guó)Mettler-Toledo公司);UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Unico公司);Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)thermo Electron公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司);DELTA 320型p H計(jì)(美國(guó)Mettler-Toledo公司);CS-H1型混合器(北京博勵(lì)陽(yáng)科技公司);96微孔板;LRH-150恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);TGL-16高速離心機(jī)(江蘇金壇中大儀器廠);各種移液器及槍頭等。

1.2材料

樣品于2007年10月采集于貴州省黔南州地區(qū),經(jīng)黔南民族師范學(xué)院教授郭治友教授鑒定為豆科錦雞兒屬植物錦雞兒(Caragana sinica)的地上部分,標(biāo)本現(xiàn)存于河南大學(xué)中藥研究所(No.20071015)。

1.3試劑

2,2'-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS,美國(guó)Fluka公司),二苯代苦味?；杂苫?DPPH,日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社),6-羥基-2,5, 7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox,美國(guó)Aldrich公司),Fe3+-三吡啶三啞嗪(TPTZ,比利時(shí)Acros organics公司),丁基羥基茴香醚(BHA,比利時(shí)Acros organics公司),沒(méi)食子酸丙酯(PG,比利時(shí)Acros organics公司),二丁基羥基甲苯(BHT,比利時(shí)Acros organics公司);α-葡萄糖苷酶(Sigma公司),對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma公司),阿卡波糖(Acarbose,Sigma公司),磷酸鹽緩沖液(p H 6.8);獺兔(雄性、體重2.0～2.5 kg,由河南大學(xué)中藥研究所提供(醫(yī)動(dòng)字09―1―2號(hào)),注射生理鹽水(山東齊都藥業(yè)有限公司),注射用燈盞花素(湖南恒生制藥有限公司,20110202),維生素K1注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司,1109051);氯化鈣溶液、枸櫞酸鈉溶液,甲醇,二甲基亞砜等為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)部分

2.1提取

取錦雞兒地上部分9 kg,干燥后粉碎,加入體積分?jǐn)?shù)10 L 70%甲醇溶液室溫下冷浸3次,每次浸泡3 d。減壓回收溶劑后,過(guò)濾除去沉淀,得到甲醇總浸膏300 g。該浸膏用1.5倍體積水分散,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,回收溶劑后,分別得到石油醚部位30 g,乙酸乙酯部位180 g,正丁醇部位75 g。

2.2抗氧化活性研究

2.2.1DPPH方法 參照文獻(xiàn)[4],將樣品和陽(yáng)性對(duì)照品用甲醇配制成濃度為2,1,0.5,0.25,0.125, 0.062 5 g/L,取0.1 m L樣品和陽(yáng)性對(duì)照品加入3.5 m L DPPH甲醇溶液(0.06 mmol/L),混合30 min后測(cè)定515 nm處吸光度。每份樣品和陽(yáng)性對(duì)照品平行操作3次,取平均值,計(jì)算出清除率,并計(jì)算出半數(shù)抑制率IC50值。

2.2.2ABTS方法 按照文獻(xiàn)[5],配制ABTS自由基工作液。將樣品和陽(yáng)性對(duì)照品用甲醇配制成濃度為2,1,0.5,0.25,0.125,0.062 5 g/L,取0.15 m L樣品和陽(yáng)性對(duì)照品加入2.85 m L ABTS自由基工作液,混合,放置10 min后,在734 nm處測(cè)定吸光度。每份樣品和陽(yáng)性對(duì)照品平行操作3次,取平均值,計(jì)算出清除率,并計(jì)算出半數(shù)抑制率IC50值。

2.2.3FRAP方法 按照文獻(xiàn)[6]和文獻(xiàn)[7],將樣品用甲醇和陽(yáng)性對(duì)照品配制成濃度為2,1,0.5,0.25, 0.125,0.062 5 g/L,取0.2 m L樣品和陽(yáng)性對(duì)照品加入3.8 m L新鮮配制的TPTZ工作液,混勻后37℃反應(yīng)30 min后測(cè)定593 nm處吸光度,每份樣品和陽(yáng)性對(duì)照品平行操作3次。取平均值,計(jì)算出清除率,結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示。

2.3體外抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

參照文獻(xiàn)[8],先進(jìn)行酶活力測(cè)定,于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。同樣的方法,加入8μL DMSO溶解的樣品溶液,測(cè)定樣品的OD值。實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)組,每組三孔,分別為:①對(duì)照組(緩沖液+酶液+底物);②空白組對(duì)照組(緩沖液);③樣品測(cè)定組(樣品+酶液+底物);④樣品對(duì)照組(樣品+緩沖液);⑤陽(yáng)性對(duì)照組(Acarbose+酶液+底物)。

按照酶活性抑制率%=(OD樣品-OD樣品空白)/(OD陰性-OD空白)×100%,用Origin軟件繪制樣品濃度與抑制率曲線,求出IC50值。

2.4體外凝血活性研究

家兔耳緣靜脈取血3.6 m L,加至含400μL含枸櫞酸鈉溶液(38 g/L)的4m L離心管中,混勻, 1 000 r/min離心15 min,取上清液備用。取1.5 m L道夫管,樣品組加入血漿0.1 m L及樣品溶液各0.1 m L,陽(yáng)性對(duì)照組加入血漿0.1 m L及藥品溶液0.1 m L,空白組加入血漿0.1 m L及空白溶劑0.1 m L于37℃溫育1 min后分別向每管加入2.775 g/L CaCl2溶液0.1 m L,計(jì)時(shí),直到檢測(cè)到纖維蛋白絲時(shí)停止計(jì)時(shí),維生素K1、燈盞花素對(duì)照組重復(fù)3次,樣品組重復(fù)6次,求算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,即為血漿復(fù)鈣時(shí)間。結(jié)果采用算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)值統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0軟件單因素方差分析法(One-Way ANOVA)比較其顯著性差異。

3　結(jié)果與討論

3.1體外抗氧化

半數(shù)清除率(IC50)指清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度,根據(jù)不同濃度抗氧化劑的清除率作曲線求出。按照上述方法和步驟,對(duì)錦雞兒地上部分的3種溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究,結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可以看出,錦雞兒3個(gè)提取部位對(duì)DPPH自由基的清除能力均較低,說(shuō)明其清除DPPH自由基的能力很差;在ABTS方法中,可以看出錦雞兒乙酸乙酯部位對(duì)ABTS自由基清除能力最強(qiáng)(IC50: 7.11 g/L),強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT,其次是錦雞兒正丁醇部位,而石油醚部位無(wú)明顯清除ABTS自由基的能力;在FRAP方法中,各提取物還原Fe3+能力順序?yàn)殄\雞兒乙酸乙酯部位＞錦雞兒正丁醇部位＞錦雞兒石油醚部位,但差于陽(yáng)性對(duì)照。由此可以看出,錦雞兒有一定的抗氧化活性,其主要的抗氧化成分主要集中在其乙酸乙酯部位,為我們進(jìn)一步追蹤其系統(tǒng)分離其抗氧化活性成分提供了線索。

3.2體外抑制α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)結(jié)果

按2.3方法,首次對(duì)錦雞兒的不同提取部位進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制活性研究,結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出,與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相比,錦雞兒各溶劑提取物均有較好的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中以錦雞兒的乙酸乙酯部位活性最好,其次為石油醚部位。

3.3體外凝血活性研究

錦雞兒石油醚部位、正丁醇部位對(duì)體外血漿復(fù)鈣時(shí)間的影響結(jié)果,見(jiàn)表3。

由表3可以看出,與空白組對(duì)比,錦雞兒石油醚部位和燈盞花素對(duì)體外凝血時(shí)間具有顯著性差別(P＜0.001),而錦雞兒石油醚部位和燈盞花素體外凝血時(shí)間無(wú)顯著性差別(P＞0.05),表明錦雞兒石油醚部位有較好的體外抗凝血作用;與空白組相比、錦雞兒正丁醇部位和維生素K1組對(duì)體外促凝血時(shí)間有顯著性差別,而正丁醇部位體外止血時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于維生素K1(P＜0.001),表示錦雞兒正丁醇部位促凝血作用明顯。

4　結(jié)論

我們首次對(duì)錦雞兒干燥地上部分的不同溶劑提取物進(jìn)行了采體外抗氧化、體外抑制α-葡萄糖苷酶活性和凝血活性的考察,結(jié)果表明:錦雞兒具有一定的抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶、抗凝血和促凝血的作用,其中其乙酸乙酯部位的抗氧化活性和體外抑制α-葡萄糖苷酶活性最強(qiáng)。這一結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)我們對(duì)錦雞兒乙酸乙酯部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)分離有重要的意義,并對(duì)錦雞兒資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了一定的理論支撐。

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[責(zé)任編輯 段金卯]

Studies on biological activities of Caragana sinica

WANG Jinmei，CHEN Long，ZHU Xiaodi，LIAN Pengli
（Institute of Chinese Material Medicine，Henan University，Kaifeng 475004，China）

Abstract：ObjectiveTo study the biological activities of Caragana sinica.MethodsThe total antioxidant activity of Caragana sinica was evaluated by three methods:DPPH radical scavenging，ABTS radical scavenging and FRAP assay，α-glucosidase inhibitory activity and anticoagulant activity in vitro were also studied.ResultsThe results showed that the ethyl acetate extract of Caragana sinica has the highest antioxidant activity andα-glucosidase inhibitory activity.ConclusionCaragana sinica has antioxidant activity andα-glucosidase inhibitory activity.

Key words：Caragana sinica；aerial part；antioxidant activity；α-glucosidase inhibitory activity；anticoagulant activity in vitro

作者簡(jiǎn)介:王金梅(1983―),女,碩士,講師,從事天然藥物活性成分研究工作。

基金項(xiàng)目:河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13B360913)。

收稿日期:2015-03-12

中圖分類號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1672―7606(2015)02―0091―03