張恩柱宋為明鄢開勝湯凌浩崔萬明

·實驗研究·

應(yīng)用行為學(xué)模型研究水楊酸致大鼠耳鳴的主要產(chǎn)生部位

張恩柱1宋為明2鄢開勝1湯凌浩1崔萬明1

目的 通過建立跳臺反射法耳鳴動物行為學(xué)模型，探討水楊酸致大鼠耳鳴的主要產(chǎn)生部位。方法40只健康Wistar大鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組20只。兩組動物分別建立跳臺反射行為學(xué)模型后，實驗組經(jīng)腹腔注射水楊酸鈉完成耳鳴動物造模，對照組腹腔注射等量生理鹽水；造模成功的實驗組動物行雙側(cè)聽神經(jīng)切斷術(shù)后，再次腹腔注射水楊酸鈉，通過動物跳臺反射行為測試再次判斷實驗組動物是否仍有耳鳴產(chǎn)生；對照組動物不行雙側(cè)聽神經(jīng)切斷術(shù)，其余實驗步驟同實驗組；比較兩組動物平均每10次刺激間隔期出現(xiàn)假陽性反應(yīng)的次數(shù)。結(jié)果 與對照組相比，實驗組動物雙側(cè)聽神經(jīng)切斷、注射水楊酸鈉2小時后，在無聲音刺激條件下單位時間內(nèi)出現(xiàn)跳臺動作頻數(shù)明顯減少，平均每10次刺激間隔期出現(xiàn)的假陽性反應(yīng)為1.59±0.12次，與對照組（2.69±0.78次）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 雙側(cè)聽神經(jīng)切斷術(shù)后水楊酸鈉注射不能使大鼠產(chǎn)生耳鳴，說明聽覺外周是水楊酸導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生耳鳴的關(guān)鍵部位。

耳鳴； 動物模型； 跳臺； 水楊酸鈉； 聽神經(jīng)切斷

水楊酸類藥物對人體具有明顯的耳毒性，長期大劑量應(yīng)用會導(dǎo)致機體出現(xiàn)可逆性高調(diào)性耳鳴及聽力下降。有研究認(rèn)為［1，2］，水楊酸對耳鳴動物造成的病理損害主要在外周聽覺系統(tǒng)，特別是耳蝸基底回的外毛細(xì)胞［1］。近年來，有許多研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸可引起耳蝸神經(jīng)、耳蝸核及顳皮層等蝸后中樞聽覺系統(tǒng)神經(jīng)元興奮性的異常改變［3，4］。本研究擬通過跳臺反射法建立耳鳴動物行為學(xué)模型，觀察水楊酸

鈉使正常大鼠產(chǎn)生耳鳴的行為學(xué)證據(jù)，并進(jìn)一步通過觀察聽神經(jīng)切斷大鼠注射水楊酸鈉后的行為學(xué)改變，探討水楊酸致大鼠耳鳴的可能產(chǎn)生部位及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性白色Wistar大鼠40只，耳道清潔，耳廓反射靈敏，對電刺激反應(yīng)敏感，體重265～420 g，平均358 g（由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）。將動物隨機分為實驗組和對照組，每組20只。

1.2 主要試劑與儀器 水楊酸鈉（美國Sigma公司）；專用屏蔽訓(xùn)練箱（自制）；大鼠跳臺儀（北京藥物研究所，DTT-2型）。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立條件反射 參考Guitton等［5］建立的跳臺反射模型建立“聲刺激-跳臺逃避”的條件反射動物行為學(xué)模型。條件刺激為外界聲音刺激（10 k Hz，60 d B SPL），持續(xù)時間5秒，非條件刺激為給予動物足底電擊（5 m A），持續(xù)時間15秒，條件刺激和非條件刺激出現(xiàn)的時間間隔為2秒，每10次訓(xùn)練為1個訓(xùn)練序列。訓(xùn)練過程中，動物受到聲刺激后，因足底受到持續(xù)電擊而產(chǎn)生向絕緣跳臺跳躍的逃避反應(yīng)，分別記錄動物在給聲期間及刺激間歇期（無聲期）是否出現(xiàn)跳臺行為反射。經(jīng)過2～4天的適應(yīng)性訓(xùn)練，動物開始將“聲信號”和“電擊”相聯(lián)系，并逐漸建立“聲刺激-跳臺逃避”的條件反射，連續(xù)4天未學(xué)會跳臺逃避的動物即被淘汰（9只）。正確反應(yīng)率（R）為給聲期間動物正確跳上跳臺的百分率，當(dāng)每只動物至少在連續(xù)3組訓(xùn)練序列中對聲音的正確反應(yīng)率≥80%即判定為條件反射建立成功。

1.3.2 耳鳴動物造模方法及動物行為監(jiān)測 31只成功建立條件反射的動物繼續(xù)進(jìn)行耳鳴動物造模實驗，觀察實驗不同階段動物的行為反應(yīng)。其觀測指標(biāo)為：假陽性反應(yīng)（FP），即平均每個訓(xùn)練序列（每天共10次訓(xùn)練）中動物在聲刺激間隔期（外界無聲刺激）的前1 min內(nèi)出現(xiàn)跳臺逃避行為的次數(shù)。

給藥方法及行為監(jiān)測分為以下2個階段：

手術(shù)前：觀察并記錄給藥前2天（第1，2天）實驗組（n＝16）和對照組（n＝15）動物的假陽性反應(yīng)次數(shù)；然后，兩組動物分別每日經(jīng)腹腔注射10%水楊酸鈉和生理鹽水350 mg／kg，連續(xù)給藥4天（第3～6天），每次給藥后2小時進(jìn)行動物跳臺反射行為測試，觀察兩組動物給藥期的行為反應(yīng)變化；停藥后繼續(xù)觀察并記錄5天（第7～11天）兩組動物的行為反應(yīng)。

手術(shù)后：實驗組動物經(jīng)雙側(cè)聽神經(jīng)切斷后，術(shù)后恢復(fù)2天后，觀察并記錄給藥前2天（第1，2天）實驗組（n＝12）和對照組（n＝11，只做切口，不切斷雙側(cè)聽神經(jīng)）動物的假陽性反應(yīng)次數(shù)；然后，兩組動物均連續(xù)4天（第3～6天）經(jīng)腹腔注射10%水楊酸鈉（350 mg／kg），觀察給藥期間兩組動物的行為學(xué)變化；停藥后繼續(xù)觀察并記錄5天（第7～11天）兩組動物的行為反應(yīng)。

1.3.3 雙側(cè)聽神經(jīng)切斷手術(shù) 實驗組大鼠完成手術(shù)前給藥及行為觀察后，經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉后手術(shù)區(qū)備皮，消毒后行耳后切口，長約1～1.5 cm。顯微鏡下暴露并打開聽泡外側(cè)壁，打開耳蝸底回，近內(nèi)耳門處仔細(xì)切斷聽神經(jīng)；用可吸收明膠海綿填塞耳蝸，縫合切口，術(shù)畢肌肉注射青霉素160萬U／kg預(yù)防感染。術(shù)后24小時后觀察大鼠進(jìn)食情況及爬行姿態(tài)，淘汰因手術(shù)死亡、術(shù)后進(jìn)食欠佳或爬行姿態(tài)異常大鼠8只，故術(shù)后實驗組動物12只，對照組動物11只。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗測得數(shù)據(jù)均經(jīng)過SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，行Shapiro-Wilks檢驗符合正態(tài)分布，對動物的假陽性反應(yīng)（PR）行t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 耳鳴動物造模結(jié)果及聽神經(jīng)切斷術(shù)前大鼠行為觀察 經(jīng)過4～6天的訓(xùn)練和強化，共31只動物（實驗組16只，對照組15只）建立了穩(wěn)定的“聲刺激-跳臺逃避”條件反射，造模成功率為77.5%（31／40）。

實驗組動物經(jīng)腹腔注射10%水楊酸鈉（350 mg／kg）期間假陽性反應(yīng)明顯增加（表1），在給藥期動物平均每10次測試中出現(xiàn)的假陽性反應(yīng)為3.90 ±1.60次，與給藥前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）；而對照組動物行為無明顯變化（P＞0.05）。說明實驗組動物注射水楊酸鈉后因感受到耳鳴，在外界無聲條件下出現(xiàn)頻繁的跳臺逃避行為，水楊酸鈉耳鳴動物模型造模成功。

表1 聽神經(jīng)切斷術(shù)前給藥前后不同時間兩組大鼠假陽性反應(yīng)次數(shù)比較（次，±s）

表1 聽神經(jīng)切斷術(shù)前給藥前后不同時間兩組大鼠假陽性反應(yīng)次數(shù)比較（次，±s）

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2.2 聽神經(jīng)切斷術(shù)后大鼠行為觀察 實驗組雙側(cè)聽神經(jīng)切斷后，給藥期間平均每10次刺激間隔期出現(xiàn)的假陽性反應(yīng)次數(shù)為1.59±0.12次，與給藥前及停藥后相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而對照組動物給藥期間平均每10次刺激間隔期出現(xiàn)的假陽性反應(yīng)為2.69±0.78次，與給藥前和停藥后比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組動物在給藥期間出現(xiàn)的假陽性反應(yīng)頻次對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。說明實驗組聽神經(jīng)損毀大鼠經(jīng)注射水楊酸鈉后并無明顯耳鳴產(chǎn)生，對照組動物在應(yīng)用水楊酸鈉后，仍可感受到耳鳴。

表2 聽神經(jīng)切斷術(shù)后給藥前后兩組大鼠假陽性反應(yīng)次數(shù)比較（次，±s）

表2 聽神經(jīng)切斷術(shù)后給藥前后兩組大鼠假陽性反應(yīng)次數(shù)比較（次，±s）

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3 討論

水楊酸類藥物具有明顯的耳毒性，利用其制作耳鳴動物模型具有誘導(dǎo)耳鳴成功率高、操作簡單、全身副作用小等優(yōu)點，因此，該方法是目前最常用、有效的探討耳鳴發(fā)生機制和治療的方法。1994年，Jastreboff等［6］利用條件反射原理，首次設(shè)計并成功建立了飲水抑制法耳鳴動物模型，為耳鳴的發(fā)生機理和治療的深入研究提供了幫助。在此原理基礎(chǔ)上，2003年Guitton等［5］建立了跳臺反射法耳鳴動物行為學(xué)模型，該方法通過將“聲刺激”作為條件刺激，并將其與“電擊-跳臺逃避反應(yīng)”在時間上進(jìn)行結(jié)合、加強并最終使動物建立“聲刺激-跳臺逃避行為”的條件反射。條件反射建立后，動物對聲音反應(yīng)敏感，條件反射穩(wěn)定，不易消退，且動物在6～7天內(nèi)對聲音的正確反應(yīng)率均可維持在80%以上，因此，較適合應(yīng)用于時間周期相對較長的耳鳴動物實驗。另外，與飲水抑制法相比，跳臺反射法動物模型建模過程中對動物的身體狀態(tài)影響較小，較適合應(yīng)用于動物身體狀態(tài)有特殊要求的實驗，如本研究中對耳鳴動物進(jìn)行的手術(shù)干預(yù)等。因此，本實驗采用跳臺反射法建立條件反射動物模型并用于動物耳鳴判定，較好地達(dá)到了實驗觀察的目的。值得提出的是，2006年Turner等［7］將動物聽覺驚跳反射應(yīng)用于耳鳴動物模型，在一定程度上避免了實驗在建立條件反射過程中對動物狀態(tài)的影響，簡化了建模過程。相信隨著該模型實驗條件的不斷完善，驚跳反射動物模型將成為未來建立耳鳴動物模型的方向之一。

耳蝸形態(tài)學(xué)研究表明，水楊酸鹽耳毒性的主要作用部位在耳蝸，特別是外毛細(xì)胞［1］，大劑量應(yīng)用水楊酸鹽可引起外毛細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)一定程度的非壞死性改變。水楊酸鈉可致耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞胞體縮小、細(xì)胞核固縮、碎裂等改變；長期大劑量應(yīng)用水楊酸鈉將導(dǎo)致螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和外毛細(xì)胞受損，而內(nèi)毛細(xì)胞無顯著改變［8］。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉可使豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，推測細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載可能是水楊酸鹽耳毒性機制之一［9］。另外，尚有許多研究表明，水楊酸導(dǎo)致動物產(chǎn)生耳鳴的過程可能有聽覺中樞核團(tuán)神經(jīng)元的參與，水楊酸可引起蝸后聽覺中樞神經(jīng)元發(fā)生神經(jīng)電生理改變，胡守森等［10］發(fā)現(xiàn)長期注射水楊酸鹽導(dǎo)致耳鳴的大鼠聽皮層中與中樞可塑性密切相關(guān)的Egr-1基因表達(dá)可逆性下調(diào)，表明聽皮層神經(jīng)元發(fā)生了可塑性改變，推測聽皮層神經(jīng)元可塑性改變可能參與了水楊酸致動物耳鳴的形成和發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，跳臺反射模型建立成功后，正常大鼠注射水楊酸鹽后在聲刺激間隔期（無聲狀態(tài)下）出現(xiàn)的跳臺動作明顯增加，證明水楊酸納可成功誘導(dǎo)動物產(chǎn)生耳鳴；而聽神經(jīng)損毀后再注射水楊酸鈉，實驗組與對照組相比，動物在聲刺激間隔期出現(xiàn)的跳臺動作明顯減少（P＜0.05），與給藥前及停藥后相比，無顯著變化（P＞0.05）；提示聽神經(jīng)損毀動物再注射水楊酸后并無耳鳴產(chǎn)生，說明外周聽覺系統(tǒng)在水楊酸誘導(dǎo)動物耳鳴的發(fā)生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可能是耳鳴產(chǎn)生的主要部位，這與最近的一些研究報道［4］較為一致。水楊酸導(dǎo)致動物產(chǎn)生耳鳴的主要作用部位可能在聽覺外周，這也許和藥物主要分布和作用部位有關(guān)，同時，水楊酸鈉導(dǎo)致聽覺外周受損必然會導(dǎo)致中樞性核團(tuán)如耳蝸核、下丘神經(jīng)元興奮性的異常改變，導(dǎo)致聽覺中樞可塑性的改變，并最終導(dǎo)致聽覺中樞對耳鳴信號的感知。

1 Jastreboff PJ.Phantom auditory perception（tinnitus）：mechanism of generation and perception［J］.Neurosci Res，1990，8：221.

2 Ruel J，Chabbert C，Nouvian R，et al.Salicylate enables cochlear arachidonic-acid-sensitive NMDA receptor responses［J］.J Neurosci，2008，28：7313.

3 Wallhausser-Franke E，Mahlke C，Oliva R，et al.Expression of c-fos in auditory and non-auditory brain regions of the gerbil after manipulations that induce tinnitus［J］.Experimental Brain Res，2003，153：649.

4 Stolzberg D，Chen GD，Allman BL，et al.Salicylate-induced peripheral auditory changes and tonotopic reorganization of auditory cortex［J］.Neuroscience，2011，180：157.

5 Guitton MJ，Caston J，Ruel J，et al.Salicylate induces tinnitus through activation of cochlear NMDA receptors［J］.J Neurosci，2003，23：3944.

6 Jastreboff PJ，Sasaki CT.An animal model of tinnitus：a decade of development［J］.Am J Otol，1994，15：19.

7 Turner JG，Brozoski TJ，Bauer CA，et al.Gap detection deficits in rats with tinnitus：a potential novel screening tool［J］. Behav Neruosci，2006，120：188.

8 Feng H，Yin SH，Tang AZ.Blocking caspase-3-dependent pathway preserves hair cells from salicylate-induced apoptosis in the guinea pig cochlea［J］.Mol Cell Biochem，2011，353：291.

9 李樹華，韓東一，楊偉炎，等［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，2002，37：47.

10 胡守森，黃治物，吳皓，等.水楊酸鹽誘發(fā)大鼠聽皮層中Egr-1基因表達(dá)的改變［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2012，20：561.

（2014-08-15收稿）

（本文編輯 周濤）

Studies on the Site of Tinnitus Genesis in the Salicylate-Rats Using Animal Behavioral Model

Zhang Enzhu*，Song Weiming，Yan Kaisheng，Tang Linghao，Cui Wanming
（*Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian，106011，China）

Objective To establish an animal behavioral model of tinnitus with step-down test，and make use of the model to analyze the tinnitus genesis site in the salicylate-rats.Methods Forty wistar rats were includscl in this study，they were randonly into 2 groups（experinent group and constrot group，20 rats each group）.Ascertain that the animals treated with sodium salicylate（SS）have the sensation of tinnitus with the method of step-down test behavioral model.After having established a behavioral conditioned reflex，subjects responded correctly to jump onto a climbing pole after hearing the sound.Then animals were under bilateral auditory nerves section，to test whether the ablated-animals could still jump onto the pole after being treated with SS.Results Animals with the ablating surgery could seldom jump onto the pole，only reaching 1.59±0.12 times average per 10 tests.Compared with control group，there were significant differences with t-Test（P＜0.05），suggesting that subjects could not hear the tinnitus after the surgery.Conclusion Sodium salicylate could not make the animals with bilateral auditory nerves section to have the sensation of tinnitus.The peripheral auditory system plays an extremely important role in salicylate-induced tinnitus.

Tinnitus； Model，animal； Step-down； Sodium salicylate； Auditory nerves section

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.03.018

時間：2015-3-4 10：26

R764.45

A

1006-7299（2015）03-0284-03

1 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（大連 106011）；

2 北京大學(xué)第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

張恩柱，男，遼寧人，碩士，主要從事耳科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究。

宋為明（Email：songwm@bjmu.edu.cn）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150304.1026.004.html