沈林海，孔慶鑫，孫建榮，徐 虹，金 慧，韋凌婭，查 捷，王英紅，倪曉平

香港海鷗形菌多重PCR及嵌合熒光PCR檢測方法的建立與應用

沈林海，孔慶鑫，孫建榮，徐 虹，金 慧，韋凌婭，查 捷，王英紅，倪曉平

目的 建立香港海鷗形菌(Laribacerhongkongensis, LH)的多重PCR(multi-PCR)及嵌合熒光法(SYBR Green I)PCR檢測方法，并對其在臨床及環(huán)境微生物方面的應用前景進行評價。方法 通過對62株香港海鷗形菌16S RNA 基因和16S-23S rRNA基因間隔區(qū)(16-23S rRNA intergenic spacer region, ISR)進行PCR擴增和多序列比對，設計兩對特異性引物，建立多重PCR體系，用15種細菌性腹瀉標準菌株及臨床菌株進行PCR特異性和敏感性檢驗；并在此基礎上針對兩對引物分別用嵌合熒光PCR法進行濃度梯度檢測，以確定最低檢測限。結果 香港海鷗形菌多重PCR法特異性為100%，最低檢出限為5×103CFU/mL菌液；而嵌合熒光PCR法兩對引物的最低檢出限均達到5×102CFU/mL菌液。結論 該法的建立為臨床及環(huán)境微生物學提供了一種快速和靈敏的香港海鷗形菌檢測手段。

香港海鷗形菌；多重PCR；嵌合熒光PCR

香港海鷗形菌(Laribacerhongkongensis, LH)作為一種新的食源性腹瀉病原菌， 2001年首次分離自中國香港的1例酒精性肝硬化患者的血液和胸腔膿液中[1]。隨后在Woo PC等人開展的一項多中心病例-對照研究中，LH在腹瀉病人及淡水魚中均被分離檢出，并被證實該菌與社區(qū)獲得性腹瀉和旅行性腹瀉有關[2-3]。Marcos和Dupont將香港海鷗形菌與產腸毒素脆弱類桿菌、產酸克雷伯菌同時列入2004-2007年間新發(fā)現的3種引起人類急性細菌性腹瀉的病原體[4]。2011年，韓國也在1例肝硬化病人的血液中首次分離到香港海鷗形菌[5]。

Lau等人對香港地區(qū)的自然水源進行調查，發(fā)現香港海鷗形菌能在淡水水源中生長[6]，又在2007年對香港地區(qū)多種淡水生物開展香港海鷗形菌帶菌調查，發(fā)現中國虎紋蛙也是LH的攜帶者[7]。我們于2005年始開展腹瀉患者與淡水魚的LH分離工作，于2005年11月在中國內地首次從一名社區(qū)獲得性腹瀉患者中分離到該菌[8]，并從3種淡水魚中分離到多株LH[9]。2006年，我們首次從涉禽小白鷺糞便樣品中分離到LH，并證實小白鷺為LH的攜帶者，并可能造成LH在不同水源間的傳播[10]。

香港海鷗形菌的分離和培養(yǎng)相對困難，目前還沒有LH的商業(yè)化鑒定試劑，自動化鑒定系統也不能對其進行鑒定，16S rRNA基因測序技術被認為是細菌鑒定的金標準，能對大多數細菌進行快速和準確的鑒定，因此也被應用于香港海鷗形菌基因診斷[1,8]。然而，基于測序的細菌鑒定方法依賴昂貴的測序儀，并需要多個工作日，并不適用于香港海鷗形菌的常規(guī)診斷及其快速診斷，因此建立香港海鷗形菌快速、準確的分子診斷方法已勢在必行。

1 材 料

1.1 菌株 62株香港海鷗形菌均由本實驗室于2005-2007年間分離，其中10株分離自社區(qū)獲得性腹瀉患者糞便標本，12株分離自小白鷺糞便標本，40株分離自淡水魚中后腸段拭子。所有菌株均經表型鑒定及16S RNA基因測序方法進行確診[8]。

嗜水氣單胞菌(ATCC 7966)、空腸彎曲桿菌(ATCC 33560)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 14028)、宋內志氏志賀菌(ATCC 9290)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、脆弱擬桿菌(ATCC 25285)、白色念珠菌(ATCC 90028)、糞腸球菌(ATCC 29212)、克雷伯氏菌屬(ATCC 13883)、變形桿菌(ATCC 12453)及艱難梭菌、大腸桿菌、類志賀鄰單胞菌、痢疾志賀菌、福氏志賀菌等臨床分離株均由澳大利亞Westmead醫(yī)院感染性疾病與微生物研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 普通PCR擴增儀、電泳系統和凝膠成像系統均為Bio-Rad公司產品；7500型熒光定量PCR儀為Applied Biosystems公司產品；基因組DNA提取試劑盒、PCR反應試劑購自德國Qiagen公司；SYBR Green I 嵌合熒光PCR試劑盒購自大連寶生物公司；引物由澳大利亞基因組研究設備有限公司合成。

2 方 法

2.1 菌株DNA提取 從麥康凱培養(yǎng)基上調取香港海鷗形菌單個菌落到LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)挑取3～5個菌落用于細菌基因組DNA提取。

2.2 香港海鷗形菌LH ISR序列PCR擴增及測序 引物LHISR1-F和LHISR1-R分別對應細菌16S rRNA基因和23S基因保守區(qū)域[11]，用于擴增香港海鷗形菌16S-23S rRNA基因間隔區(qū)全長序列，引物序列見表1。PCR反應總體積為25 μL，含1×PCR緩沖液，1.5 mmol/L Mg2+，100 μmol/L dNTPs，500 nmol/L上下游引物，0.5 U熱啟動酶，2 μL模板DNA。PCR反應程序為95 ℃ 熱啟動15 min， 94 ℃ 變性1 min， 60 ℃ 退火1 min， 72 ℃ 延伸2 min，循環(huán)35次，72 ℃ 10 min，4 ℃ 結束程序。PCR擴增產物經2%瓊脂糖(含1∶20 000 GelRed染料)電泳，在凝膠成像系統下進行分析，符合預期的PCR產物經純化后送測序作進一步分析。

2.3 多序列比對分析和多重PCR引物設計 將182個16S rRNA基因序列(包含60個LH、102個Chromobacterium、14個Vogesella和 6個Microvirgula的16S rRNA基因序列)以及本實驗測序所得的62個LH ISR基因序列作多序列比對分析(Clustal W 1994)，分析結果用于LH種特異性引物設計。利用Primer 5.0引物設計軟件自行設計兩對引物LH16S-F/LH16S-R和LHISR2-F/LHISR2-R，并用BLASTn搜索軟件進行引物特異性分析，引物序列見表1。

2.4 定量DNA模板的制備和多重PCR檢測方法的建立 將香港海鷗形菌菌株LHHZ242含量由5×107CFU/mL 10倍梯度稀釋到5×10-1CFU/mL，不同濃度分別提取DNA模板進行多重PCR檢測。多重PCR反應總體積為25 μL，含1×PCR緩沖液，1.5 mmol/L Mg2+，100 μmol/L dNTPs，500 nmol/L各條引物，0.5 U熱啟動酶，2 μL模板DNA。PCR反應程序為95 ℃熱啟動15 min， 94 ℃變性1 min， 60 ℃退火1 min， 72 ℃ 延伸2 min，循環(huán)35次，72 ℃ 10 min，4 ℃ 結束程序。PCR擴增產物經2%瓊脂糖(含1∶20 000 GelRed染料)電泳，在凝膠成像系統下進行分析。

2.5 嵌合熒光法的PCR反應體系 參照試劑盒說明書，反應總體積為25 μL，含1×SYBR Premix EXTAQTMII，400 nmol/L上下游引物，1×ROX Reference Dye，4 μL模板DNA。熒光PCR反應程序為Stage 1：95 ℃ 預變性30 s；Stage 2：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40次；Stage 3：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，95 ℃ 15 s。

表1 PCR引物序列

3 結 果

3.1 多序列比對分析結果 香港海鷗形菌16S rRNA基因高度保守，總長為1 524 bp的序列僅有0～3個堿基差異，相似度大于99.8%，其多態(tài)性堿基位置為第424、425和430。香港海鷗形菌的16S-23S rRNA基因間隔區(qū)長度為恒定471 bp，且高度保守，僅有0～5個堿基差異，相似度大于98.9%，其多態(tài)性堿基位置為第53、355、358、374和379。

3.2 多重PCR特異性檢測結果 利用多重PCR法對10個標準菌株和5個臨床分離菌株DNA進行PCR特異性檢驗。結果表明，62株香港海鷗形菌DNA菌擴增出兩條目的條帶，229 bp和95 bp，其他DNA樣品未見特異性擴增條帶(圖1)。

M: DNA marker; 1: LHHZ242 positive control; 2: Blank control; 3-17: DNA of reference strains.

圖1 香港海鷗形菌多重PCR特異性檢測電泳圖

Fig.1 Multi-PCR electrophoresis for specific detection of LH

3.3 多重PCR敏感度檢測結果 多重PCR法對稀釋度為5×107CFU/mL至5×10-1CFU/mL的香港海鷗形菌菌液DNA模板進行敏感度檢測，結果發(fā)現，兩對引物均在第5泳道出現最弱條帶，檢測的敏感度為5×103CFU/mL(圖2)。

M: DNA marker; 1-9: Various bacterial suspension of LHHZ242 from 5×107CFU/mL to 5×10-1CFU/mL; 10: Blank control.

圖2 香港海鷗形菌多重PCR敏感度檢測電泳圖

Fig.2 Sensitiveness of multi-PCR for detection of LH

3.4 嵌合熒光PCR法檢測結果 用嵌合熒光PCR法對稀釋度為5×107CFU/mL至5×10-1CFU/mL的香港海鷗形菌菌液DNA模板進行濃度梯度檢測，結果顯示：引物LH16S-F/LH16S-R和LHISR2-F/LHISR2-R均可檢測到6個濃度的信號，其最低檢測限均為5×102CFU/mL菌液(圖3)。

4 討 論

細菌16S rRNA基因相對保守，但又存在著9或10個變異區(qū)，不同屬和種間都有不同程度的差異。16S-23S rRNA基因間隔區(qū)(16-23S rRNA intergenic spacer region, ISR)的進化速度是16S rRNA基因的10倍[12]，并且其兩端的序列高度保守，使得它可以用于親緣性異常接近菌種的鑒別，也能用于細菌的分型[11]。自香港海鷗形菌被首次發(fā)現以來，還未見香港海鷗形菌16S rRNA基因序列或16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列的同源性分析報道。本研究發(fā)現，香港海鷗形菌16S rRNA基因序列高度保守，且與其他親緣菌株序列有較大差異；其16S-23S rRNA基因間隔區(qū)長度恒定并高度保守，并在GenBank數據庫中未發(fā)現相識性序列。因此，香港海鷗形菌16S rRNA和ISR區(qū)域均可作為種特異性PCR引物設計區(qū)。Yuen KY等用系統進化樹的方法發(fā)現Chromobacterium，Microvirgula和Vogesella等菌屬與LH的親緣關系最近[1]，而有趣的是這些細菌都能從水環(huán)境中檢出。通過對這些細菌的16S rRNA基因序列進行比對，我們設計的LH種特異性引物能夠特異性擴增LH基因，而不會擴增這些親緣關系最近的細菌基因。這就使我們能快速鑒定環(huán)境樣品中的LH，為研究環(huán)境中LH的來源和分布提供了條件，也為研究和尋找LH新種或亞型提供了可能。其次，我們用臨床常見腸道致病菌檢測引物的特異性，發(fā)現引物并不能擴增這些菌株的16S rRNA基因或ISR基因，并且均未發(fā)現非特異性擴增條帶。所以本實驗設計的種特異性引物能用于臨床細菌樣品的LH PCR鑒定，而兩對引物構成的多重PCR體系更能提高檢出的特異性，而并不影響PCR反應的靈敏度。

Amplification curve of primers LH16S-F/LH16S-R; Fig below: Amplification curve of primers LHISR2-F/LHISR2-R; Concentration gradient: Various bacterial suspension of LHHZ242 from 5×107CFU/mL to 5×10-1CFU/mL.

圖3 香港海鷗形菌嵌合熒光PCR法敏感度檢測結果

Fig.3 Sensitiveness of SYBR Green I real-time RAM for detection of LH

香港海鷗形菌在SS、XLD、CCDA、TCBS等培養(yǎng)基上不生長或者生長不良，雖然Lau SK等人發(fā)現改良頭孢哌酮麥康凱(CMA)可以作為分離LH的合適培養(yǎng)基，但其在CMA上生長緩慢，37 ℃下培養(yǎng)48 h后菌落大小約為0.5～1 mm，且菌落形態(tài)特征不明顯、為無色透明扁平狀，且難以在混雜的眾多菌落中區(qū)分和挑取[9,13]?？梢删涮羧『螅€需要細菌分純、表型和生化鑒定等步驟。因此，用傳統微生物鑒定法分離LH很大程度上依賴于檢驗者長期積累的經驗和技術，不僅費時費力，且容易漏檢和誤檢。而種特異性多重PCR方法能在培養(yǎng)24 h后即能對難挑菌落和可疑菌落進行鑒定，雖不能完全取代傳統培養(yǎng)分離法，但更為迅速和靈敏。

嵌合熒光PCR法為一種簡單的實時熒光定量PCR，所用染料 SYBR Green I 能結合于雙鏈DNA微槽而增加熒光強度，從而具有高靈敏度，而引物特異性決定了嵌合熒光PCR的特異性[14]。本研究采用嵌合熒光PCR法分別檢測香港海鷗形菌16S rRNA基因和ISR基因，結果顯示其熒光強度與模板濃度成正比，最低檢測限均達到5×102CFU/mL菌液，為普通PCR靈敏度的10倍。而且嵌合熒光PCR免去了瓊脂糖凝膠電泳的步驟，明顯縮短了檢測時間。因此，嵌合熒光PCR法擁有高特異性、高靈敏度及快速檢測等優(yōu)勢，更適用于香港海鷗形菌爆發(fā)流行的快速診斷，或者大批量及低濃度樣品的檢測。

(澳大利亞Westmead醫(yī)院感染性疾病與微生物研究中心對本研究提供了資助及實驗所用菌株，孔繁榮博士在研究實施及論文寫作期間給予了精心的協助和指導，在此一并感謝！)

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Development and application of multi-PCR and SYBR Green I real-time ramification amplification method for detection ofLaribacerhongkongensis

SHEN Lin-hai,KONG Qin-xin,SUN Jian-rong,XU Hong,JIN Hui,WEI Ling-ya,ZHA Jie,WANG Ying-hong,NI Xiao-ping

(HangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310006,China)

We aimed to establish multi-PCR and SYBR Green I real-time ramification amplification method (RAM) for detection ofLaribacerhongkongensis, and evaluate the applications of two methods in both clinical and environmental microbiology. Full-length of the 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA intergenic spacer region (ISR) sequences of 62L.hongkongensisisolates were obtained by PCR based sequencing. Two species-specific primer pairs targeting 16S rRNA gene and ISR were designed for multi-PCR and SYBR Green I real-time RAM for detection ofL.hongkongensis, and the specificity and sensitivity of two methods were evaluated by 15 strains associated with bacterial diarrhea. Results showed that LH species-specific multi-PCR assay had high specificity (100%) and the minimum detectable level was 5×103CFU/mL; the minimum detectable levels of two primer pair were both 5×102CFU/mL by SYBR Green I real-time RAM. The multi-PCR method and SYBR Green I real-time RAM provide rapid and reliable alternative to conventional methods to identifyL.hongkongensis, and may have applications in both clinical and environmental microbiology.

Laribacterhongkongensis; multi-PCR method; SYBR Green I real-time RAM

Ni Xiao-ping, Email: hznixp@163.com

倪曉平，Email: hznixp@163.com

杭州市疾病預防控制中心，杭州 310021

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.014

R446.5

A

1002-2694(2015)07-0659-04

2014-07-18；

2015-01-28

浙江省重點科技創(chuàng)新團隊項目(2011R50021)；杭州市科技計劃引導項目(2014-2)

Funded by the Program for Zhejiang Leading Team of Science Technology Innovation and the Science and Technology Guiding Projects of Hangzhou city (No. 2014-2)