羅文麗,邱聰齡,余煒嘉,劉志剛,2,吉坤美,2,蔡澤浪,2

粉塵螨α-烯醇化酶基因的克隆表達(dá)、純化及其N(xiāo)端B細(xì)胞表位的初步鑒定

羅文麗1,邱聰齡1,余煒嘉1,劉志剛1,2,吉坤美1,2,蔡澤浪1,2

目的 克隆表達(dá)粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)α-烯醇化酶(alpha-enolase，ENOA)基因，初步研究其N(xiāo)端B細(xì)胞表位與自身免疫性疾病的關(guān)系。方法 ①設(shè)計(jì)特異性引物，從文庫(kù)中克隆ENOA cDNA；②通過(guò)BamH I/EcoR I雙酶切位點(diǎn)，將ENOA基因克隆至pET-His原核表達(dá)載體，表達(dá)純化，獲得了重組ENOA蛋白；③測(cè)定重組ENOA酶活性；④通過(guò)Swiss-Model軟件模擬ENOA蛋白3D結(jié)構(gòu)，并分析其潛在的N端B細(xì)胞表位；合成ENOA的N端表位肽，測(cè)定其與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清IgG的反應(yīng)性。結(jié)果 ①克隆了ENOA全長(zhǎng)cDNA (GenBank 登錄號(hào)KJ421213.1)；②成功構(gòu)建了pET-His-ENOA 表達(dá)載體，經(jīng)純化獲得了重組ENOA蛋白。③重組蛋白具有烯醇化酶活性；④瓜氨酸修飾的合成表位肽與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)患者血清IgG-ELISA呈陽(yáng)性反應(yīng)，與健康對(duì)照組血清均不呈反應(yīng)(P<0.05 )。結(jié)論 本課題首次克隆表達(dá)的重組ENOA蛋白具有烯醇化酶活性；其N(xiāo)端B細(xì)胞表位與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。本研究為塵螨與自身免疫性疾病的相關(guān)性研究提供了新的思路。

粉塵螨；α-烯醇化酶；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)；表位

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自身免疫性疾病如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)等患者機(jī)體存在一類(lèi)抗體，對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而損害自身組織[1]。研究發(fā)現(xiàn)α-烯醇化酶(α-Enolase，ENOA)不僅是體內(nèi)參與糖酵解途徑的催化酶，而且作為一個(gè)多功能的分子參與人類(lèi)自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病以及癌癥等多種疾病的病理生理過(guò)程。Rattner等首次報(bào)道了系統(tǒng)性風(fēng)濕疾病患者體內(nèi)存在抗α-Enolase抗體[2]?？功?Enolase的自身抗體通過(guò)識(shí)別膜結(jié)合形式的α-Enolase從而干擾其功能導(dǎo)致誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)[3]。Andrew Kinloch等[4]研究表明類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)患者體內(nèi)也存在抗α-Enolase抗體，α-Enolase可發(fā)生瓜氨酸化，從而刺激生物體產(chǎn)生自身抗原特異的抗體。此外，紅斑狼瘡患者血清與重組酵母α-Enolase具有交叉抗原抗體結(jié)合反應(yīng)[5]。

塵螨是最主要的室內(nèi)吸入性致敏原，可引起多種過(guò)敏性疾病，如過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎等。致敏塵螨物種主要包括粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae，Der f)和屋塵螨(Derpmaatophagoidespteronyssinus，Der p)[6-7]等，目前已經(jīng)分離鑒定并正式命名了24組塵螨過(guò)敏原成份，它們與過(guò)敏性疾病的關(guān)系比較明確[8]。但塵螨與自身免疫性疾病是否相關(guān)尚待研究[9-10]。本課題在解析了粉塵螨轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)上[8]，通過(guò)同源比對(duì)尋找到粉塵螨α-烯醇化酶cDNA序列，進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并初步探討它是否存在交叉抗原表位，從而與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎ENOA自身抗體反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與材料 實(shí)驗(yàn)中使用的粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)cDNA文庫(kù)和大腸埃希氏菌E.coliTOP10、表達(dá)載體pET-His vector由深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所保存。質(zhì)粒提取、瓊脂糖凝膠DNA回收、DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、BamH I及EcoR I、T4 DNA ligase購(gòu)自TaKaRa公司，蛋白分子量Marker購(gòu)自Fermentas公司， Ni2+-Chelating Sepharose及層析柱購(gòu)自GE公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.1.2血清 64例RA患者血清及26例健康對(duì)照血清標(biāo)本來(lái)源于深圳市第二人民醫(yī)院，其中，RA血清標(biāo)本：男34例，女30例，年齡26～72歲；健康對(duì)照血清標(biāo)本：男15例，女11例，年齡22～60歲。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1粉塵螨ENOA的 cDNA克隆 根據(jù)同源比對(duì)分析結(jié)果，在粉塵螨基因組中找到編號(hào)(Locus tag)為DEFA_132640的ENOA對(duì)應(yīng)的同源基因。以粉塵螨cDNA文庫(kù)為模板，根據(jù)ENOA的序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，上游和下游引物的序列分別為：

5’-ATGTCCATTCAAAAGATTTATG-3’，5’-TTAAATTGGATGACGGAAATTT -3’。通過(guò)PCR得到產(chǎn)物，電泳檢測(cè)并切膠回收，經(jīng)轉(zhuǎn)化克隆到pMD19-T載體上挑取單菌落，進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果。

1.2.2粉塵螨ENOA編碼基因的人工合成 選用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，優(yōu)化設(shè)計(jì)粉塵螨ENOA編碼基因序列，人工合成該基因，5’端含有BamH I酶切位點(diǎn)，3’端含有終止密碼和EcoR I酶切位點(diǎn)，合成基因克隆pUC57載體上測(cè)序確認(rèn)，該實(shí)驗(yàn)由南京金斯瑞公司完成。

1.2.3 pET-His-ENOA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與原核表達(dá) 將pUC57-ENOA 雙酶切BamH I/EcoR I后電泳回收目的基因，克隆至原核表達(dá)載體pET-His，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-His-ENOA，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)plysS感受態(tài)，挑選抗氨芐青霉素(Amp)陽(yáng)性菌落，加入20 mL含100 μg/mL Amp的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，過(guò)夜培養(yǎng)。次日轉(zhuǎn)種到1L滅菌的新鮮LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；待細(xì)菌生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A600nm=0.6左右)時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。3 h后4 ℃離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳來(lái)檢測(cè)表達(dá)情況。

1.2.4 重組ENOA蛋白純化 以10 mL/g濕菌體的比例加入適量50 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl(pH8.0)蛋白抽提溶液，混勻并加入溶菌酶，冰浴攪拌溶解30 min；冰浴超聲波破碎細(xì)菌后4 ℃離心(10 000 r/min) 20 min，取上清液上樣到Ni2+-Chelating Sepharose層析柱進(jìn)行蛋白純化，測(cè)定蛋白濃度和SDS-PAGE純度。

1.2.5 重組ENOA催化活性的測(cè)定 參照Pancholi報(bào)道的方法[11]測(cè)定粉塵螨ENOA的酶催化活性，ENOA可將2-磷酸甘油酸(2-phosphoglyceric acid，2-PGA)轉(zhuǎn)化成磷酸烯醇式丙酮酸phosphoenolpyruvic acid, PEP)，此過(guò)程可通過(guò)240 nm吸光度的變化進(jìn)行檢測(cè)。配制酶活檢測(cè)緩沖液后，加入2 mmol/L的2-PGA，充分混勻；加入終濃度為20 μg/mL的高純度粉塵螨ENOA蛋白混勻，迅速檢測(cè)240 nm波長(zhǎng)處的紫外吸收值，以10 s為間隔，連續(xù)測(cè)定3 min；以BSA作為陰性對(duì)照蛋白，繪制在240 nm時(shí)的吸光度吸光度變化曲線。

1.2.6 ENOA 3D結(jié)構(gòu)模擬及RA相關(guān)表位肽的合成 以人ENOA 3D結(jié)構(gòu)(PDB：2psnA)作為參考模板，運(yùn)用在線軟件SWISS-MODEL對(duì)粉塵螨ENOA 3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，獲得其3D模擬結(jié)構(gòu)。J. D. Goules等[12]研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸(Citrulline，Cit)化的ENOA可刺激類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者產(chǎn)生對(duì)自身ENOA特異結(jié)合的IgG抗體。結(jié)合粉塵螨ENOA 3D結(jié)構(gòu)分析其N(xiāo)端B細(xì)胞表位，并合成瓜氨酸化的粉塵螨ENOA和人ENOA的RA相關(guān)表位肽，序列如下(Cit為瓜氨酸)：

表位肽位置氨基酸序列DustMite_ENOA(5-21aa)CKIYA(Cit)QIFDS(Cit)GNPTLEHuman_ENOA(5-21aa)CKIHA(Cit)EIFDS(Cit)GNPTVE

1.2.7 IgG-ELISA試驗(yàn)及其統(tǒng)計(jì)分析 用碳酸鹽緩沖液(pH9.0)將粉塵螨ENOA和人ENOA表位肽稀釋至4 μg/mL，取96孔酶標(biāo)板，每孔加入100 μL， 置于4℃包被過(guò)夜；用含5% BSA的PBS溶液37 ℃封閉2 h；按照1∶5的比例稀釋RA患者血清及陰性對(duì)照血清37 ℃孵育1 h； 1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG 37 ℃孵育1 h；用TMB進(jìn)行顯色，室溫避光靜置10 min后，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)；在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。應(yīng)用SPSS13.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05即為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Pearson方法對(duì)相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 粉塵螨ENOA cDNA克隆及其分析

2.1.1 粉塵螨ENOA的cDNA克隆和測(cè)序分析 以粉塵螨cDNA文庫(kù)為模板，根據(jù)ENOA的序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，進(jìn)行PCR合成得到ENOA的cDNA(圖1)克隆后進(jìn)行Sanger測(cè)序分析。結(jié)合粉塵螨基因組和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析[8],本研究克隆了ENOA cDNA全長(zhǎng)序列，共1 302 bp，編碼 433個(gè)氨基酸，已登錄GenBank (Accession No.KJ421213.1)。

M：DNA分子量 DL2000；1：ENOA cDNA PCR產(chǎn)物

M: DL2000 DNA marker; Lane 1: Products of ENOA cDNA.

圖1 PCR擴(kuò)增ENOA cDNA電泳圖譜

Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product of ENOA cDNA

2.1.2 粉塵螨ENOA蛋白序列同源檢索 登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLAST軟件在線進(jìn)行蛋白質(zhì)同源檢索，結(jié)果顯示本研究克隆的ENOA屬于類(lèi)烯醇化酶超家族中的一員，氨基酸序列與人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)和果蠅(Drosophilamelanogaster)的ENOA同源性分別為72%、71%和65%(圖2)。

圖2 粉塵螨ENOA氨基酸序列與其它物種間的比對(duì)

2.2 粉塵螨ENOA基因的人工合成、表達(dá)及其蛋白純化

2.2.1 pET-ENOA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 依據(jù)粉塵螨ENOA蛋白的CDS編碼的氨基酸序列，采用E.coli偏愛(ài)密碼子人工合成粉塵螨ENOA基因，經(jīng)DNA測(cè)序確正后申請(qǐng)GenBank，登錄號(hào)為No. KJ421214.1。該基因 5’端和3’端分別含BamHI和EcoRI位點(diǎn)。將ENOA目的基因克隆至表達(dá)載體pET-HisBamHI和EcoRI之間，雙酶切鑒定并經(jīng)DNA序列確證(圖3)。

M：DNA標(biāo)志物 DL2000；1:pET-His-ENOABamHI/EcoRI雙酶切產(chǎn)物

M: DL2000 DNA Marker; Lane 1: products of pET-His-ENOA double cut byBamHI/EcoRI.

圖3 pET-His-ENOA重組質(zhì)粒BamHI/EcoRI雙酶切

Fig.3 Electrophoresis of products of pET-His-ENOA double cut byBamHI/EcoRI

2.2.2 原核系統(tǒng)表達(dá)ENOA重組蛋白 測(cè)序正確的pET-His-ENOA重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE23)plysS，誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，分別處理誘導(dǎo)前后菌體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，目的條帶大小為47 kDa左右(如圖4)。重組蛋白溶液經(jīng)Ni2+Sepharose FF柱層析純化，濃縮后上樣Superdex200層析純化， 經(jīng)SDS-PAGE分析獲得純的重組ENOA蛋白,濃度為1.2 mg/mL(如圖4)。

2.3 重組ENOA酶活性測(cè)定 ENOA酶可轉(zhuǎn)化2-PGA為PEP；在240 nm波長(zhǎng)下, PEP具有較高的吸光度, 而PGA的吸光度很低。2-PGA加入BSA后在240 nm時(shí)的吸光度無(wú)變化，BSA在此實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)出酶催化活性；而2-PGA加入重組ENOA蛋白后在240 nm時(shí)的吸光度不斷增加，并在一定時(shí)間后趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)出酶催化活性(圖5)。

2.4 ENOA蛋白3D結(jié)構(gòu)與RA相關(guān)表位分析

2.4.1 粉塵螨ENOA蛋白 3D結(jié)構(gòu)模擬 利用SWISS-MODEL在線軟件，參考模板(template: 2psnA)對(duì)粉塵螨ENOA蛋白進(jìn)行同源建模，模擬其3D分子結(jié)構(gòu)(圖6)。預(yù)測(cè)粉塵螨ENOA蛋白結(jié)構(gòu)模型中，α螺旋含量為45%，β折疊片為45%。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物；1：誘導(dǎo)前；2： IPTG誘導(dǎo)；3：重組蛋白經(jīng)Ni Sepharose親和層析純化；4：重組蛋白經(jīng)Superdex 200凝膠過(guò)濾層析純化M: Pre-stained Protein Ladder; Lane 1: Before introduction; Lane 2: After introduction by IPTG; Lane 3: rENOA protein purified by Ni2+chelating resin; Lane 4: rENOA protein purified by Superdex 200 gel filtration.

圖4 pET-His-ENOA重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)純化

Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant ENOA

圖5 重組ENOA酶催化活性測(cè)定

圖6 粉塵螨ENOA蛋白 3D結(jié)構(gòu)模擬

2.4.2 人工合成與RA相關(guān)的表位肽 粉塵螨ENOA表位肽：CKIYA(Cit)QIFDS(Cit)GNPTLE，分子量為2113.44，HPLC分析合成肽純度>98%，其中N端Cys含有SH，便于偶聯(lián)到BSA上。人ENOA表位肽：CKIHA(Cit)EIFDS(Cit)GNPTVE，分子量2074.36，HPLC分析合成肽純度>98%，其中N端Cys含有SH，便于偶聯(lián)到BSA上。

2.4.3 IgG-ELISA測(cè)定表位肽與RA患者血清結(jié)合反應(yīng) 取64份RA患者血清及26份健康對(duì)照血清作為檢測(cè)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，粉塵螨ENOA表位肽與RA患者血清IgG的結(jié)合率為17.2%(11/64)，與健康人血清無(wú)結(jié)合活性(cut off值為0.353)，見(jiàn)圖7(P<0.05)。人ENOA表位肽與RA患者血清IgG的結(jié)合活率為10.9% (7/64)，與1例健康人血清有結(jié)合活性(cut off值為0.3478)，見(jiàn)圖8(P<0.05)，結(jié)合率低于J. D. Goules等[17]的報(bào)道(37.59%)，可能與不同人群有關(guān)。粉塵螨ENOA表位肽與人ENOA表位肽兩者結(jié)合RA患者IgG抗體具有較高的相關(guān)性(R2=0.9522，P<0.05)，見(jiàn)圖9。

圖7 粉塵螨ENOA表位肽與RA患者及健康對(duì)照血清IgG結(jié)合反應(yīng)

Fig.7 IgG binding reactivity by Der f α-enolase epitope peptide against IgG antibodies from RA serum and healthy controls respectively

圖8 人ENOA表位肽與RA患者及健康對(duì)照血清IgG結(jié)合反應(yīng)

Fig.8 IgG binding reactivity by human α-enolase epitope peptide against IgG antibodies from RA serum and healthy controls respectively

圖9 粉塵螨ENOA表位肽和人ENOA表位肽與RA血清IgG結(jié)合反應(yīng)的相關(guān)性比較

Fig.9 Correlation between IgG binding activity of Der f α-enolase and human α-enolase epitope peptides against IgG antibodies from RA patient’s serum

3 討 論

3.1 粉塵螨α-烯醇化酶的克隆表達(dá)及酶活性測(cè)序 本課題組基于高通量測(cè)序解析了粉塵螨基因組和轉(zhuǎn)錄組[8]；這有利于克隆粉塵螨未知基因開(kāi)展新的研究。本研究克隆的粉塵螨ENOA cDNA序列1 302 bp，編碼433個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成；克隆測(cè)序結(jié)果與高通量測(cè)序后拼接的轉(zhuǎn)錄組序列一致。此外序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，ENOA在不同物種之間的序列同源性較高，這說(shuō)明ENOA基因在不同物種生物體內(nèi)是高度保守的。本研究獲得了可溶性表達(dá)具有酶活性的重組粉塵螨ENOA，為進(jìn)一步研究提供了生物原材料。

研究表明,真菌中 α-Enolase是一類(lèi)高度保守的過(guò)敏原[13]；在部分霉類(lèi)和乳膠過(guò)敏患者體內(nèi)表現(xiàn)過(guò)敏原性；α-Enolase在鏈格孢霉(Alternariaalternata)和多主枝孢菌(Cladosporiumherbarum)過(guò)敏患者中具有較高的IgE結(jié)合活性[14]；天然乳膠中的主要過(guò)敏原Hev b 9就是α-Enolase，它與霉菌α-Enolase有交叉反應(yīng)性[15]。研究報(bào)道鏈格孢霉(A.alternata)的α-Enolase——Alt a 5是該真菌的第二組主要過(guò)敏原，22%的鏈格孢霉過(guò)敏患者中均檢測(cè)到抗α-Enolase IgE活性[16]。在多主枝菌(C.herbarum)α-Enolase相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，同樣作為該真菌的第二主要過(guò)敏原的α-Enolase在22%的多主枝孢菌(C.herbarum)過(guò)敏患者中檢測(cè)到IgE陽(yáng)性[17-18]。此外，在人念珠菌(Candidaalbicans)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的α-Enolase作為主要過(guò)敏原并具有交叉反應(yīng)性[19]。粉塵螨是過(guò)敏性疾病最主要的過(guò)敏原來(lái)源之一，從這一物種中發(fā)現(xiàn)新的過(guò)敏原蛋白成分是研究過(guò)敏性疾病的基礎(chǔ)[20]。本研究最初設(shè)想克隆粉塵螨α-Enolase研究其致敏原性，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組粉塵螨α-Enolase與過(guò)敏患者及健康對(duì)照者血清IgE均有相當(dāng)一部分反應(yīng)，兩組無(wú)顯著差異；粉塵螨α-Enolase是否是過(guò)敏原尚待進(jìn)一步研究。

3.2 粉塵螨ENOA與人ENOA自身免疫交叉反應(yīng) 人體內(nèi)有多種蛋白與細(xì)菌、病原體等外來(lái)抗原具有一定的氨基酸序列同源性，這些外來(lái)抗原有可能與人體自身蛋白產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)[1]。粉塵螨ENOA作為外來(lái)抗原，與人體自身ENOA抗原氨基酸序列同源性高達(dá)72%，可能形成為共同交叉抗原；由交叉抗原刺激人體產(chǎn)生的抗粉塵螨ENOA的抗體，可與有關(guān)人體組織中人ENOA發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，有可能進(jìn)一步引起免疫損傷。

在本研究中，我們模擬粉塵螨ENOA蛋白的3D結(jié)構(gòu)，分析其潛在的B表位區(qū)段，結(jié)合與人ENOA表位區(qū)段的分析，設(shè)計(jì)合成了粉塵螨ENOA與人ENOA的表位肽(5-21aa)，檢測(cè)ENOA表位肽是否結(jié)合RA患者血清IgG。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)粉塵螨ENOA表位肽與部分RA患者血清的IgG結(jié)合，與健康對(duì)照血清無(wú)結(jié)合活性；粉塵螨ENOA的表位肽和人ENOA表位肽結(jié)合RA患者血清IgG抗體水平具有較高的相關(guān)性(R2=0.9522)。這表明粉塵螨ENOA與人ENOA存在抗原交叉反應(yīng)性。一直以來(lái)，塵螨是否與自身免疫性疾病相關(guān)缺少確切的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；本研究發(fā)現(xiàn)提供了直接線索。但粉塵螨與自身免疫性疾病的確切關(guān)系需要進(jìn)一步深入研究。

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Cloning and expression of alpha-enolase gene fromDermatophagoidesfarinaeand identification of its N-terminal B-cell epitope

LUO Wen-li1,QIU Cong-ling1,YU Wei-jia1,LIU Zhi-gang1,2,JI Kun-mei1,2,CAI Ze-lang1,2

(1.InstituteofAllergyandImmunology,SchoolofMedicine,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China;2.ShenzhenKeyLaboratoryofAllergyandImmunology,Shenzhen518060,China)

We aimed to clone and express cDNA of alpha-enolase from the dust miteDermatophagoidesfarina(Der f), and study the relationship between its N-terminal B-cell epitope and autoimmune disease. The cDNA of α-enolase was amplified from Der f cDNA library and sub-cloned into a pET-His vector to express inE.coliBL21(DE3)plysS. Recombinant α-enolase was purified and its enzyme activity was determined. The 3D structure was constructed by Swiss-Model. The N-terminal epitope peptide was synthesized and subjected to IgG-ELISA with the patients’ serum of rheumatoid arthritis vs healthy controls. Results showed that the gene encoding α-enolase was cloned from Der f (GenBank accession No. KJ421213.1). The pET-ENOA expression vector was constructed. High pure recombinant α-enolase was obtained with enzyme activity. ELISA demonstrated IgG binding to the citrullinated peptide from 11 of 64 rheumatoid arthritis (RA) patients’ serum samples, but was not bound by IgG antibodies from 26 healthy controls (P<0.05). The present study cloned and expressed α-enolase cDNA from the dust mite. The findings have revealed the dust mite α-enolase might be associated with human rheumatoid arthritis.

Dermatophagoidesfarina; alpha-enolase; rheumatoid arthritis；epitope

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31328014，No.31400786)、廣東省自然科學(xué)基金(No.2014A030313563)、深圳市科技計(jì)劃(No. JCYJ20120613113021045， JCYJ20130326112225593)

蔡澤浪, Email:szuczlang@163.com

1.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳 518060； 2.深圳市過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.012

R384.4；R593.22

A

1002-2694(2015)07-0649-06

2014-11-26；

2015-06-03