吳學(xué)敏，陳如敬，車勇良，王隆柏，陳秋勇，嚴(yán) 山，劉玉濤，周倫江

豬偽狂犬病病毒與豬圓環(huán)病毒2型雙重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

吳學(xué)敏1，陳如敬1，車勇良1，王隆柏1，陳秋勇2，嚴(yán) 山1，劉玉濤1，周倫江1

目的 為建立一種能同時(shí)鑒別豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)混合感染的診斷方法。方法與結(jié)果 根據(jù)GenBank中公布的豬偽狂犬病病毒和圓環(huán)病毒2型的基因序列，分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增長度分別為612 bp和238 bp。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，與PRV“Yangsan”株和PCV2“JX0301”株的同源性分別為98.6%和99.2%。通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立同時(shí)檢測PRV和PCV2的雙重PCR方法。利用該方法對(duì)臨床采集的78份疑似病料進(jìn)行檢測，其中59份為PCV2陽性，17份PRV陽性，其中11份為PRV和PCV2共感染。結(jié)論 建立的雙重PCR檢測方法可以用于PRV和PCV2的臨床快速鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

豬偽狂犬病病毒；豬圓環(huán)病毒病2型；雙重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus Type2，PCV2)感染引起的病毒性疫病，主要引起斷奶豬的多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征、A2型先天性振顫、豬呼吸道綜合征等疾病[1-3]，該病毒是目前發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒，對(duì)豬具有免疫抑制特性[3-5]。豬偽狂犬病是由豬感染偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，主要特征是發(fā)熱和腦脊髓炎，成年豬多為隱性感染，新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，可引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，尤其以產(chǎn)死胎較為嚴(yán)重[1-2,6-7]。目前，經(jīng)血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查證實(shí)該兩種病原已呈世界性分布，并給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。豬PCV2的感染率較高，具有很強(qiáng)的免疫抑制作用，大大降低了豬對(duì)其它病原的抵抗力，從而引發(fā)多病原的混合感染，爆發(fā)疫病[4,10-11]；PRV在豬體內(nèi)多呈隱性感染，并可終生帶毒，在一定條件下可激活發(fā)病并向外散毒，個(gè)體感染后難以根除[12-14]。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR技術(shù)建立了同時(shí)檢測區(qū)分豬圓環(huán)病毒和豬偽狂犬病病毒野毒的檢測方法，為豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒混合感染的早期診斷提供了靈敏、快速、特異的有效方法。

1 材料與方法

1.1 供試毒株 豬偽狂犬病病毒(Pseudo rabies virus，PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissible gastroenteritis，TGE病毒)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)均由本研究所分離并保存。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的豬偽狂犬病病毒gE基因和豬圓環(huán)病毒2型cap基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物PRV-F、PRV-R和PCV2-F、PCV2-R，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為612 bp和238 bp，由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列如下：

PCV2-F：5′-GGCGTTACACGGAGAGAGAC-3′

PCV2-R：5′-CCTCCTGGGGGAAGAAAGTC-3′

PRV-F：5′-AACTATGGCATGACCGCCAA-3′

PRV-R：5′-GTGGAGAAGAAGAGTCCGGC-3′

1.3 病毒核酸提取 利用Roche(羅氏)公司病毒核酸提取試劑盒，根據(jù)說明書步驟，分別提取以PK細(xì)胞分離到的PRV和PCV2病毒核酸，采用紫外線吸收法測其濃度，于-70 ℃冰箱存放備用。

1.4 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 以提取PRV和PCV2的DNA為模板，根據(jù)PCR反應(yīng)的基本條件，及所設(shè)計(jì)引物的TM值溫度范圍，進(jìn)行優(yōu)化PCR反應(yīng)的退火溫度。

PCR反應(yīng)的總體積為25 μL：2×GoTaq Master Green Mix 13.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，無菌去離子水補(bǔ)充至終體積為25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 1 min，退火1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束，取5 μL于1%的瓊脂糖凝膠電泳，拍照觀察結(jié)果。

1.5 特異性測定 以PPV、PRV、PCV2病毒的DNA，及CSFV、TGE病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板。取等量的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以無菌的去離子水做陰性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠拍照分析。

1.6 雙重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 以提取的PRV和PCV2核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并同時(shí)對(duì)兩種引物進(jìn)行配比和退火溫度的優(yōu)化，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.7 敏感性測定 以細(xì)胞分離的PRV和PCV2病毒，分別提取DNA，并用紫外分光的方法測定濃度，并做10倍系列稀釋成濃度為1 μg/μL至1 pg/μL，分別以不同濃度的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.8 重復(fù)性測定 將提取PRV和PCV2的DNA作為模板，以初步建立的該檢測方法，做6次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢驗(yàn)該方法的穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測 從臨床采集到疑是該兩種病的病料共78份，經(jīng)研磨反復(fù)凍融處理后，用Roche(羅氏)公司的DNA提取試劑盒分別提取病毒DNA，利用本實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測，并設(shè)立陰陽性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 PCR結(jié)果 以提取的PRV和PCV2的DNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到約612 bp和238 bp大小的條帶(如圖1、2)，與預(yù)期的結(jié)果一致，而對(duì)照樣品均無特異性擴(kuò)增。并將產(chǎn)物送至上海生工公司測序，結(jié)果與GenBank公布的PRV“Yangsan”株(登錄號(hào)：AY249861)和PCV2“JX0301”株(登錄號(hào)：AY651850)相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列進(jìn)行比較，同源性分別為98.6%和99.2%。

2.2 雙重PCR條件優(yōu)化 退火溫度經(jīng)梯度式優(yōu)化，及以PRV引物和PCV2引物的不同配比進(jìn)行PCR反應(yīng)，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，其最佳的退火溫度為57 ℃，兩對(duì)引物的比例為2∶3最佳。

2.3 特異性試驗(yàn) 特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，該體系對(duì)PPV、TGE和CSFV的PCR反應(yīng)均無擴(kuò)增條帶，僅對(duì)PRV和PCV2的核酸有特異性擴(kuò)增，表明該雙重PCR反應(yīng)體系特異性強(qiáng)。

2.4 敏感性試驗(yàn) 不同濃度模板PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，該體系對(duì)PRV和PCV2的核苷酸濃度為1 μg/μL-100 pg/μL均能擴(kuò)增出特異性條帶，對(duì)10 pg/μL和1 pg/μL無擴(kuò)增，說明該體系對(duì)PRV和PCV2核苷酸的擴(kuò)增下限濃度為100 pg/μL。

M: DL2000Marker; 1: PRV; 2: PCV2;3: PPV; 4: CSFV; 5: TGE; 6: Negative control (ddH2O).

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果(PRV)

Fig.1 Result of PCR (PRV)

M: DL2000Marker; 1: PCV2; 2: PRV; 3: PPV; 4: CSFV; 5: TGE; 6: Negative control (ddH2O).

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果(PCV-2)

Fig.2 Result of PCR (PCV-2)

M: DL2000 Marker; 1: PRV和PCV2; 2: PPV; 3: TGE; 4: CSFV; 5: Negative control (ddH2O).

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.3 Specificity result of the detection method

M: DL2000 Marker; 1: 1 μg/μL; 2: 100 ng/μL; 3: 10 ng/μL; 4: 1 ng/μL; 5: 100 pg/μL; 6: 10 pg/μL; 7: 1 pg/mL; 8: Negative control (ddH2O).

圖4 雙重PCR檢測方法的靈敏性

Fig.4 Sensitivity result of the duplex PCR

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 以PRV和PCV分離株提取的核酸，用該方法重復(fù)做6次PCR反應(yīng)，均存在兩條條帶，大小分別為612 bp和238 bp，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品檢測 從福建省的不同地區(qū)共采集78份豬病料，用建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如表1所示，PRV的陽性率為21.8%(17/78)，PCV的陽性率為75.6%(59/78)，兩者均陽性占14.1%(11/78)。

3 討 論

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化集約化的發(fā)展，及調(diào)豬活動(dòng)的頻繁，豬偽狂犬病和豬圓環(huán)病毒病逐漸嚴(yán)重危害著豬群的健康[15-16]。目前臨床上廣泛采用PRV基因工程缺失苗進(jìn)行免疫保護(hù)，也造成有些豬存在PRV潛伏感染的可能，從而導(dǎo)致隱性感染豬長期帶毒或向外排毒，而無法使全場凈化豬偽狂犬病病毒[13-15]。從2010年年底開始至今，由我國北方地區(qū)開始，多個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場爆發(fā)了疑似PRV感染的疾病，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并從發(fā)病豬病料中分離到新的毒株[17]。豬圓環(huán)病毒是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒，PCV2具有免疫抑制特性，能感染豬淋巴器官中的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，并使該兩種細(xì)胞的數(shù)量減少，而外周血和淋巴組織中的巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞數(shù)量升高，同時(shí)淋巴組織中的巨噬細(xì)胞發(fā)生浸潤，從而可引起繼發(fā)性的免疫缺陷疾病[10-11]。在臨床上PRV與PCV2感染率較高，還常形成混合感染，很難做出準(zhǔn)確的診斷，因此對(duì)PRV和PCV2建立一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法，對(duì)疫病的早期診斷及有效防制有著重要的意義。國內(nèi)外對(duì)PRV和PCV2進(jìn)行了大量的研究，也不斷從臨床分離到病毒，目前也已經(jīng)建立了多種檢測方法，如間接免疫熒光法(IFA)、免疫組織化學(xué)法(IHC)、ELISA抗體檢測方法、PCR及多重PCR檢測技術(shù)等[18]。

表1 PRV和PCV2的檢測結(jié)果

本研究利用PCR檢測方法敏感、快速且易于操作的優(yōu)點(diǎn)，基于PRV與PCV2病毒均為DNA病毒，根據(jù)它們的保守序列各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，成功建立了同時(shí)檢測此兩種病毒的雙重PCR檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法同時(shí)可檢測PRV和PCV2病毒，對(duì)PPV、CSFV和TGE病毒檢測均為陰性。該方法具有特異性強(qiáng)、快速易于操作，對(duì)臨床采集的病料進(jìn)行檢測，表明臨床發(fā)病豬感染PCV2的比例要高于PRV感染的，并有14.1%發(fā)病豬同時(shí)感染兩種病毒，應(yīng)注意該兩種疾病的疫苗免疫預(yù)防。因此，該雙重PCR檢測方法為PRV和PCV2的流行病學(xué)調(diào)查及臨床診斷提供一種方法。

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Establishment and application of a duplex PCR for detecting pseudorabies virus and porcine circo virus type 2

WU Xue-min1,CHEN Ru-jing1,CHE Yong-liang1,WANG Long-bai1,CHEN qiu-yong2,YAN Shan1,LIU Yu-tao1,ZHOU Lun-jiang1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgricultureSciences/FujianAnimalDiseaseControlTechnologyDevelopmentCenter,Fuzhou350013,China;2.CollegeofAnimalSciences,FujianAgriculturalandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)

We established a sensitive detection method for pseudorabies virus (PRV) and porcine circovirus type 2 (PCV2). Specific primers for detecting PRV and PCV2 were designed according to the full sequences of each virus strain obtained from GenBank, the length of amplification fragment were respectively 612 bp and 238 bp. The result of sequencing showed that the nucleotide homologies were 98.6% and 99.2% respectively compared with PRVYangsanand PCV2JX0301 sequences. A multiplex PCR was established to detect PRV and PCV2 by optimizing the PCR programs. The established assay was successfully used to detect PRV and PCV2 in 78 clinical samples, of which 11 samples were positive for PRV and PCV2, 59 samples for PCV2 and 17 samples for PRV. Results indicated that the established duplex PCR assay was suitable for rapid detection and epidemic surveillance of PRV and PCV2.

pseudorabies virus; porcine circovirus type 2; duplex PCR

Zhou Lun-jiang, Email:Email：lunjiang@163.com

周倫江，Email：lunjiang@163.com

1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013； 2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350002

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.008

R373.9

A

1002-2694(2015)07-0631-04

2014-09-01；

2015-09-06

福建省自然科學(xué)基金科研項(xiàng)目(No.2014J01107)，福建省公益類科研項(xiàng)目(No.2012R1025-8)

Supported by the funds of Fujian Science Research Project (No. 2014J01107) and the funds of Fujian Public Research Project (No. 2012R1025-8)