楊江華，孫 靜，梁曼曼，盛浩宇，王文節(jié)

抑制Kupffer細(xì)胞功能減輕日本血吸蟲(chóng)病肝臟肉芽腫炎癥反應(yīng)

楊江華，孫 靜，梁曼曼，盛浩宇，王文節(jié)

目的 通過(guò)制備氯磷酸二鈉脂質(zhì)體(LE-Cl2MDP)，選擇性剔除日本血吸蟲(chóng)感染小鼠模型中Kupffer 細(xì)胞，研究抑制Kupffer 細(xì)胞功能對(duì)日本血吸蟲(chóng)肝臟肉芽腫形成的影響。方法 采用脂質(zhì)體包裹CL2MDP；6～8周齡雌性BALB/c小鼠分為3組： PBS組，日本血吸蟲(chóng)感染組，日本血吸蟲(chóng)感染聯(lián)合LE-Cl2BMP組；對(duì)于聯(lián)合組，小鼠尾靜脈注射LE-Cl2MDP(0.1 mL/10 g)，每周2次，連續(xù)6周；感染后第12周，剝殺小鼠，留取血清及肝臟，用于細(xì)胞因子和免疫組織化學(xué)檢測(cè)等，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 經(jīng)過(guò)LE-Cl2MDP處理后，日本血吸蟲(chóng)感染肉芽腫周?chē)鶮upffer細(xì)胞細(xì)胞明顯減少；無(wú)論是感染第8周，還是第12周肝組織中蟲(chóng)卵肉芽腫周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，纖維化程度減輕；同時(shí)降低感染第12周小鼠血清IL-10水平，LE-Cl2MDP組為(42.6±10.4)pg/mL，感染組為(67.4±12.9)pg/mL(P<0.05)。結(jié)論 本研究建立LE-Cl2MDP剔除小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞的日本血吸蟲(chóng)感染模型，抑制了肝組織中蟲(chóng)卵肉芽腫周?chē)装Y反應(yīng)。

血吸蟲(chóng)病；Kupffer細(xì)胞；氯磷酸二鈉；脂質(zhì)體

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81141083) and the Key Natural Science Foundation of Universities of Anhui Province (No. KJ2014A271)

血吸蟲(chóng)病是一種免疫性疾病。血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原引起的肝腸組織肉芽腫及隨之發(fā)生的纖維化、甚至硬化，是慢性和晚期病人的主要病理表現(xiàn)。血吸蟲(chóng)病肝纖維化是由血吸蟲(chóng)感染人體后，蟲(chóng)卵致肝內(nèi)血管阻塞或蟲(chóng)卵及其肉芽腫分泌成纖維細(xì)胞刺激因子等，使肝內(nèi)纖維組織(尤其是膠原)增生過(guò)多、降解和吸收減少所致的病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)Kupffer細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等均參與這一反應(yīng)，其中Kupffer細(xì)胞通過(guò)多種機(jī)制參與血吸蟲(chóng)病肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[1-2]。

為研究日本血吸蟲(chóng)病肉芽腫及肝纖維化行程中Kupffer 細(xì)胞的作用地位及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備脂質(zhì)體包裹的氯甲雙磷酸鹽 (liposome-encapsulated dichloromethylene diphosphonate,LE-Cl2MDP)，選擇性剔除日本血吸蟲(chóng)感染小鼠模型中Kupffer 細(xì)胞(肉芽腫形成前)，研究抑制Kupffer 細(xì)胞功能對(duì)日本血吸蟲(chóng)肝臟肉芽腫炎癥反應(yīng)以及纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與陽(yáng)性釘螺 6～8周齡雌性BALB/c小鼠(SPF級(jí))，購(gòu)自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，陽(yáng)性釘螺購(gòu)自江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所。

1.2 試劑和儀器 實(shí)驗(yàn)試劑有膽固醇、卵磷脂、氯磷酸二鈉(CL2MDP)、Percoll均為美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；免疫組化抗體抗小鼠F4/80為美國(guó)Serotec公司。細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒有：IL-4、TGF-β和IL-10為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(ZFA202型) 為上海玻璃儀器二廠(chǎng)；C500 MPL流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECKMAN COULTER公司產(chǎn)品。

1.3 脂質(zhì)體的制備 方法參照文獻(xiàn)[3]，分別取卵磷脂70 mg、膽固醇20 mg、CL2MDP 20 mg，將CL2MDP溶于5 mL PBS中，卵磷脂、膽固醇(7∶2)放入燒杯中，加入15 mL氯仿溶解。將CL2MDP溶液加入燒杯中，磁力攪拌10 min，水浴中間隙超聲振蕩5 min，25 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至糊狀。再加少量PBS，再次減壓蒸發(fā)，除去氯仿，得脂質(zhì)體懸液。微孔濾膜過(guò)濾，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用前將脂質(zhì)體重新懸浮在4 mL滅菌的PBS中。

1.4 動(dòng)物模型及處理 6～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組，每組15只：對(duì)照組(PBS組)，日本血吸蟲(chóng)感染組，日本血吸蟲(chóng)感染聯(lián)合LE-Cl2BMP組。PBS組，給予尾靜脈注射PBS；日本血吸蟲(chóng)感染組，通過(guò)腹部感染尾蚴20條/只；日本血吸蟲(chóng)感染聯(lián)合LE-Cl2BMP組，在腹部感染尾蚴后第6周，尾靜脈注射LE-Cl2MDP(0.1 mL/10 g)，每周2次，連續(xù)6周，共12次。感染后第12周，剝殺小鼠，留取血清及肝臟，用于細(xì)胞因子檢測(cè)或石蠟包埋。

1.5 肝臟組織學(xué)觀(guān)察 小鼠肝組織經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作厚3 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察肝組織病變情況，分別隨機(jī)觀(guān)察5個(gè)肉芽腫周?chē)装Y細(xì)胞分類(lèi)與數(shù)量，以及膠原纖維沉著等。

1.6 免疫組化檢測(cè)肝臟Kupffer細(xì)胞 采用SP法，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；3% H2O2室溫孵育5～10 min；山羊血清封閉，孵育10 min；滴加10 μL的抗小鼠F4/80抗體，37 ℃孵育2 h；滴加適當(dāng)比例生物素標(biāo)記二抗；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色；顯微鏡下觀(guān)察。

1.7 細(xì)胞因子檢測(cè) 采用小鼠ELISA 測(cè)定小鼠血清細(xì)胞因子IL-4、IL-10和TGF-β的表達(dá)水平，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品以及待測(cè)樣本加入反應(yīng)孔，相應(yīng)作雙復(fù)孔。根據(jù)不同濃度下標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再檢測(cè)待測(cè)樣本血清細(xì)胞因子的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化檢測(cè)小鼠肝臟Kupffer數(shù)量 圖1顯示，在PBS組小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞定居于肝竇，形狀不規(guī)則，胞體伸入竇周間隙，與肝細(xì)胞直接接觸。在日本血吸蟲(chóng)感染組肉芽腫周?chē)写罅縆upffer細(xì)胞增生，包繞肉芽腫。經(jīng)過(guò)LE-Cl2MDP處理后，肉芽腫周?chē)鶮upffer細(xì)胞細(xì)胞明顯減少。免疫組化檢測(cè)示小鼠Kupffer細(xì)胞數(shù)量(抗小鼠F4/80表達(dá)陽(yáng)性)在PBS組為(15.2±1.7)個(gè)，在日本血吸蟲(chóng)感染組肉芽腫中為(19.6±2.1)個(gè)，在LE-Cl2MDP聯(lián)合感染組肉芽腫中為(9.1±1.2)個(gè)(P<0.05)。

2.2 組織學(xué)變化 肝組織學(xué)研究結(jié)果顯示，LE-Cl2MDP顯著減輕日本血吸蟲(chóng)肉芽腫周?chē)装Y反應(yīng)程度(圖2)。PBS組肝組織切片鏡下：肝臟小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，匯管區(qū)無(wú)蟲(chóng)卵沉積，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生。日本血吸蟲(chóng)感染組第8周時(shí)病理切片所示，肝組織中出現(xiàn)較大的蟲(chóng)卵肉芽腫，周?chē)写罅渴人嵝粤＜?xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；第12周時(shí)還有大量纖維結(jié)締組織增生。而LE-Cl2MDP組顯示，無(wú)論是感染第8周，還是第12周肝組織中蟲(chóng)卵肉芽腫周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，纖維化程度減輕。

圖1 F4/80 陽(yáng)性細(xì)胞在小鼠肝臟組織中的表達(dá)(抗小鼠F4/80，×400)

圖2 LE-Cl2MDP減輕日本血吸蟲(chóng)病肉芽腫周?chē)装Y反應(yīng)程度

Fig.2 LE-Cl2MDP relieved the degree of inflammatory response in schistosomiasis granuloma

2.3 細(xì)胞因子水平 本組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明在血吸蟲(chóng)感染第12周小鼠血清IL-10水平為67.4±12.9 pg/mL，顯著高于正常對(duì)照組(21.5±9.6)pg/mL(P<0.01)，而LE-Cl2MDP組為(42.6±10.4)pg/mL(P<0.05)。此外，LE-Cl2MDP也能降低IL-4與TGF-β的水平。

表1 血清細(xì)胞因子水平

3 討 論

Kupffer細(xì)胞是肝臟內(nèi)重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，雖僅占肝臟體積的2%，卻承擔(dān)著機(jī)體單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)功能的80%～90%，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境恒定上起重要作用。目前研究證實(shí)Kupffer細(xì)胞可作為調(diào)節(jié)性抗原遞呈細(xì)胞下調(diào)機(jī)體免疫應(yīng)答，參與纖維化的形成[4]。肝基質(zhì)微環(huán)境誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性APC，能夠釋放抑制性細(xì)胞因子如IL-10 和TGF-β；高表達(dá)CD32、CD14和某些Toll樣受體；低表達(dá)CD54、CD40、CD80、CD86等協(xié)同刺激分子及黏附分子[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是小鼠模型還是人體血吸蟲(chóng)感染，肉芽腫及肝纖維化的形成總是與機(jī)體呈現(xiàn)Th2型免疫應(yīng)答相伴隨，此時(shí)機(jī)體內(nèi)Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β1等大量產(chǎn)生并分泌于血液中。TGF-β被認(rèn)為是導(dǎo)致肝纖維化的主要細(xì)胞因子[5]，見(jiàn)于多種肝臟損傷模型，包括酒精性肝纖維化、血吸蟲(chóng)病、CCL4致肝纖維化等，而且參與多種慢性肝臟疾病的纖維化形成。實(shí)驗(yàn)表明Kupffer細(xì)胞除了能夠分泌IL-10、TGF-β1等細(xì)胞因子參與血吸蟲(chóng)病肝纖維化之外，還能誘導(dǎo)HSC表面表達(dá)PDGF受體[6]，從而對(duì)PDGF起反應(yīng)導(dǎo)致HSC增生。Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的膠原也能導(dǎo)致HSC表型改變。

鑒于血吸蟲(chóng)病肝纖維化發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，參與因素很多，Kupffer細(xì)胞可能參與肝纖維化各個(gè)機(jī)制和階段中，在纖維化的病理改變中扮演重要腳色。因此，為研究Kupffer細(xì)胞參與肝臟病理生理過(guò)程的機(jī)制以及在這些過(guò)程中的作用，有效剔除肝臟Kupffer細(xì)胞能建立，從而為探討其功能提供奠定基礎(chǔ)。本課題組既往使用三氯化釓(gadolinium chloride，GdCL )作為肝臟Kupffer細(xì)胞的抑制劑而研究其的功能，取得初步成果[7-8]。然而GdCL對(duì)肝細(xì)胞細(xì)胞有一定毒性，很難應(yīng)用到人體，并且它的作用機(jī)制復(fù)雜難以操作。因此，有必要探索其它合適方法，因具有可操作，作用機(jī)制明確。

研究指出[9]，體內(nèi)注射LE-Cl2MDP可以選擇性地清除巨噬細(xì)胞。用于包埋的脂質(zhì)體成分是卵磷脂和膽固醇，是細(xì)胞膜組成成分，本身沒(méi)有毒性。巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬作用攝取LE-Cl2MDP，其磷脂酶破壞脂質(zhì)體的磷脂雙分子層，藥物得以在細(xì)胞內(nèi)釋放，從而誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的凋亡。因此，LE-Cl2MDP運(yùn)載藥物可成為臨床治療某些疾病的有效手段[10]。此外，LE-Cl2MDP被廣泛應(yīng)用于巨噬細(xì)胞功能的研究[11]。

本研究建立了LE-Cl2MDP有效剔除小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞的模型，為進(jìn)一步研究Kupffer細(xì)胞如何參與機(jī)體代謝功能，解毒功能以及免疫調(diào)節(jié)功能，提供新的手段。圖1顯示在日本血吸蟲(chóng)感染組肉芽腫周?chē)写罅縆upffer細(xì)胞增生，包繞肉芽腫。經(jīng)過(guò)LE-Cl2MDP處理后，肉芽腫周?chē)鶮upffer細(xì)胞明顯減少。免疫組化檢測(cè)小鼠Kupffer細(xì)胞數(shù)量在PBS組為(15.2±1.7)個(gè)，在日本血吸蟲(chóng)感染組肉芽腫中為(19.6±2.1)個(gè)，在LE-Cl2MDP聯(lián)合感染組肉芽腫中為(9.1±1.2)個(gè)。此外，LE-Cl2MDP顯著減輕日本血吸蟲(chóng)肉芽腫周?chē)装Y反應(yīng)程度(圖2)。第8周時(shí)日本血吸蟲(chóng)感染組病理切片所示，肝組織中出現(xiàn)較大的蟲(chóng)卵肉芽腫，周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)；第12周時(shí)還有大量纖維結(jié)締組織增生。而LE-Cl2MDP組顯示，無(wú)論第8周，還是第12周肝組織中蟲(chóng)卵肉芽腫周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，纖維化程度減輕。這種作用機(jī)制可能是由于LE-Cl2MDP抑制Kupffer細(xì)胞功能，從而下調(diào)IL-4、IL-10和TGF-β的表達(dá)水平。

由此，本研究建立了LE-Cl2MDP剔除小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞的日本血吸蟲(chóng)感染模型，將有助于闡明日本血吸蟲(chóng)感染后期免疫下調(diào)的機(jī)制以及Kupffer細(xì)胞調(diào)控血吸蟲(chóng)病肉芽腫形成及參與的可能機(jī)制。此外，如果能夠抑制Kupffer細(xì)胞的增生和分化或阻斷其調(diào)控途徑，或許能夠下調(diào)其免疫抑制功能，或?yàn)檠x(chóng)慢性感染以及纖維化的治療尋找一條新途徑。

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Inflammatory response of schistosomiasis hepatic granuloma by inhibiting the function of Kupffer cells

YANG Jiang-hua,SUN Jing,LIANG Man-man,SHEN Hao-yu,WANG Wen-jie

(DepartmentofInfectiousDiseases,YijishanHospital,WannanMedicalCollege,Wuhu241001,China)

Liposome-encapsulated dichloromethylene diphosphonate (LE-Cl2MDP) was prepared to selectively eliminate out Kupffer cells in a mouse model ofSchistosomajaponicainfection. Further studies by inhibiting the effects of Kupffer cell function were implemented to judge whether it impacted on the liver granuloma formation ofSchistosomajaponicainfection. Liposome was used to package CL2MDP. The 6-8 weeks old female BALB/c mice were divided into three groups, including phosphate buffered saline (PBS) group,Schistosomajaponicainfection group andSchistosomajaponicainfection combined LE-Cl2BMP group. The combination group model was reproduced by injection of LE-Cl2BMP into tail vein (0.1 mL/10 g) for twice a week through six weeks. Mice were sacrificed at 12 week post infection withSchistosomajaponicum, serum and liver specimens were collected to detect cytokines and immunohistochemistry, etc. Statistical analysis was performed based on relevant data. Results showed that after LE-Cl2MDP treatment, Kupffer cells ofSchistosomajaponicaegg granuloma significantly reduced. Inflammatory cells infiltration surrounding schistosome egg granuloma in liver also decreased significantly, and that alleviated hepatic fibrosis at 8 or 12 week. At 12 weeks after infection, the level of IL-10 in the sera of the mice with schistosomiasis infection combined LE-Cl2MDP group (42.6 10.4) pg/mL was significantly lower than that of schistosomiasis infection group (67.4 12.9) (P<0.05). This study established the model that LE-Cl2MDP was able to eliminate the hepatic Kupffer cells in the mice infected withSchistosomajaponicum, and it also inhibited inflammatory response around schistosomal egg granuloma.

schistosomiasis; Kupffer cells; dichloromethylene diphosphonate; lipidosome

國(guó)家自然科學(xué)基金(81141083)和安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A271)

皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院感染性疾病科，蕪湖 241001； Email:yjhpath@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.006

R383.24

A

1002-2694(2015)07-0623-04

2014-10-14；

2015-05-11