曾 航，張玉林，王 麟，劉 鵬，王 玲

實時熒光定量PCR對兔戊型肝炎病毒(HEV)的檢測及評估

曾 航，張玉林，王 麟，劉 鵬，王 玲

目的 兔戊型肝炎病毒(HEV)是近年來新發(fā)現(xiàn)的，根據(jù)其分子生物學(xué)特征可能成為HEV的新基因型。為提高對兔HEV的檢出率，本研究設(shè)計了針對兔HEV RNA的特異性引物和TaqMan探針并對其進(jìn)行考評。方法 1)從GenBank中下載14條兔HEV全長序列，分別在其ORF1、ORF3片段的保守區(qū)域設(shè)計一條TaqMan探針和一對上、下游特異性引物，其中ORF1片段的探針及引物為C組，ORF3片段的為B組；A組的探針及引物為Jothikumar N等所報道的通用引物；2)制備相應(yīng)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品來構(gòu)建定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用上述3套引物、探針對49份兔糞便及44份兔血液樣品進(jìn)行檢測，將B、C組檢測結(jié)果與A組的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 新建立了兩套兔HEV定量PCR的TaqMan探針及引物(B、C組)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為-3.455和-3.469；使用上述3套引物及探針(A、B、C組)對49份糞便標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR檢測，其HEV RNA陽性率分別為67.35%(33/49)、67.35%(33/49)、57.14%(28/49)，平均HEV RNA(log copies/g)拷貝數(shù)為6.18、5.90、6.11；44份血液標(biāo)本的HEV RNA陽性檢出率分別為65.90%(29/44 )、56.82%(25/44)、50.00%(22/44)，平均HEV RNA(log copies/mL)拷貝數(shù)為3.62、3.43、3.03；結(jié)果顯示以上3組探針及引物均可用于糞便和血液標(biāo)本的定量檢測。結(jié)論 兔HEV雖然有其獨特的基因結(jié)構(gòu)，但使用HEV通用引物檢測不影響檢出率。

兔HEV；TaqMan探針；引物；實時熒光定量PCR

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271827) and the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20120001110098) Corresponding author: Wang Ling, Email: lingwang@bjmu.edu.cn

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)為直徑27～34 nm、無包膜的球形顆粒。病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約7.2 kb，由5′端7甲基鳥甘酸帽結(jié)構(gòu)、5′端非編碼區(qū)、3′端非編碼區(qū)、3′端多聚腺苷酸尾和3個開放閱讀框(open reading frame, ORF)組成[1]。根據(jù)病毒核酸序列分析，目前HEV主要分為1～4個基因型(G1～G4)，其中1、2型只感染人，3、4型為人獸共患病原體[2]。自美國學(xué)者首次從豬體內(nèi)分離到HEV以來，已經(jīng)在很多種動物體內(nèi)分離到HEV，包括禽類、貓鼬、鹿、鼠、鱒魚、野豬、雪貂、狐貍、駱駝[3-11]，此外還有很多動物雖然未分離到HEV，但其抗體陽性率很高，說明HEV在自然界中廣泛傳播。

2009年，我國學(xué)者[12]首次報道了從兔子體內(nèi)分離到新的HEV病毒株，此后世界各地學(xué)者也相繼報道了當(dāng)?shù)赝萌褐蟹蛛x到新的兔HEV病毒株[13-14]，而且其抗-HEV抗體和核酸陽性率也均較高。深入的研究顯示兔HEV與已知的G1～G4的基因組結(jié)構(gòu)有明顯差異，可能是一個新的基因型，并且兔HEV可以實驗感染豬和非人靈長類動物[15]，提示有潛在感染人的可能性，對公眾健康構(gòu)成潛在威脅。

目前聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)仍然是檢測HEV的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16]，尤其是定量PCR能夠較精確的定量出HEV的基因拷貝數(shù)，這對于了解病毒在體內(nèi)復(fù)制、清除和病程的轉(zhuǎn)歸、慢性化及臨床療效預(yù)后等具有重要意義。但迄今HEV的定量檢測尚無統(tǒng)一方法，目前較受廣泛認(rèn)可的是Jothikumar N[17]所報道的檢測方法，由于兔HEV和基因1～4型HEV的核苷酸同源性<80%[18]，它是否也同樣適用于兔HEV定量檢測尚不清楚，針對兔HEV的定量PCR方法也尚無報道。因此，為提高對兔HEV的檢出率，本實驗擬設(shè)計針對兔HEV的特異性引物和TaqMan探針，并與目前廣泛認(rèn)可的通用引物、探針進(jìn)行兔HEV檢出率的比較。

1 材料與方法

1.1 引物及探針的設(shè)計 從GenBank下載所收錄的兔HEV全序14株(GenBank登錄號：JQ768461、FJ906895、FJ906896、KJ013414、KJ013415、GU937805、JQ013791、JQ013792、JQ013793、JX121233、JX565469、AB740220、AB740221、AB740222)，利用Mega5.0軟件進(jìn)行序列同源性比對分析，確定出保守區(qū)序列。參考株為CHN-BJ-R14(GenBank登錄號：JX121233)[15]，利用Primer primer5.0軟件在保守區(qū)設(shè)計2套引物和探針(B組、C組)，并用NCBI的BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)驗證引物對于HEV基因組的特異性。Oligo7.0軟件分析引物和探針的GC含量、解鏈溫度、末端穩(wěn)定性、二級結(jié)構(gòu)等各項參數(shù)。引物和探針均由上海生物工程有限公司合成。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品曲線的構(gòu)建

1.2.1 目的基因片段的克隆 以CHN-BJ-R14病毒株的基因組為模板，擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因片段，取擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%(1.5 g/100 mL)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。鑒定正確后，按照DNA凝膠回收試劑盒(購自北京白泰克生物技術(shù)有限公司)說明書純化回收PCR產(chǎn)物。將純化回收的PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體(美國Promega公司)連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后，涂布Amp+瓊脂平板，篩選陽性克隆，搖菌擴(kuò)增培養(yǎng)，提取并純化質(zhì)粒(質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康潤誠業(yè)生物技術(shù)有限公司)，取20 μL質(zhì)粒送北京六合華大基因服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，并用軟件Mega5.0將測序結(jié)果與CHN-BJ-R14全基因序列進(jìn)行比對分析，以確定獲得正確的目的基因克隆。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋及質(zhì)?？截悢?shù)的計算 用NanoDrop2000(美國賽默飛世爾科技公司)測定上述質(zhì)粒母液的質(zhì)量濃度(ng/μL)，對其依次進(jìn)行109～100倍梯度稀釋制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照以下公式將質(zhì)粒質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒拷貝數(shù)(C)：質(zhì)?？截悢?shù)=(質(zhì)粒質(zhì)量濃度/分子質(zhì)量)×6.23×1023[18]。最終得到每2 μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度(copies/2 μL)為：A組5×109～5×100，B組3×109～3×100, C組3×109～3×100。

1.3 標(biāo)本RNA提取及定量 標(biāo)本來自本實驗室前期接種了CHN-BJ-R14病毒株的實驗兔，包括糞便49份、血液44份。取100 μL血清或糞便懸液(10% w/v)標(biāo)本，根據(jù)TRIzol reagent (Invitrogen, Burlington, ON, Canada)說明書抽提RNA，最終用20 μL RNase-Free水溶解，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。?biāo)本RNA檢測采用一步法熒光定量PCR(TransScript? Probe one-Step qRT-PCR Super Mix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測，每個樣品做3個反應(yīng)復(fù)孔，以降低組內(nèi)差異，反應(yīng)體系為20 μL：模板RNA 2 μL，正、反向引物1 μL(10 μmol/L)，TaqMan探針0.5 μL(10 μmol/L)，qPCR Mix 10 μL，Enzyme Mix 0.4 μL，RNase-free water 5.1 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：45 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，1個循環(huán)；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)將自動生成結(jié)果(Roche LightCycler? 480定量PCR儀)。

1.4 標(biāo)本檢出率的比較 以1.2.2中稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，用相應(yīng)的引物、探針及優(yōu)化后的條件進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，并以超純水代替模板為空白對照，檢測其靈敏性。用本實驗設(shè)計的兩組TaqMan探針、引物(B、C組)及通用引物探針(A組)同時對血液、糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，比較這3組的RNA陽性檢出率。

2 結(jié) 果

2.1 引物及探針 將GenBank登錄的14株兔HEV全基因序列比對后，于ORF1近5′端、ORF3等片段的保守區(qū)域設(shè)計兩組相應(yīng)的引物和探針，分別命名為ORF1(C組)、ORF3(B組)，其正、反向引物及探針分別為ORF1-F、ORF1-R、ORF1-P；ORF3-F、ORF3-R、ORF3-P；Jothikumar N等所報道的引物和探針命名為A組(通用引物)分別為JVHEVF、JVHEVR、JVHEVP。

表1 兔HEV定量PCR引物及探針

Note: FAM, fluorescein amidite; BHQ, black hole quencher; a,corresponding nucleotide position of HEV virus (Accession No.M73218); b,corresponding nucleotide position of HEV virus (Accession No. JX121233 ). Y=C, T; R=A,G;M=A,C;W=A,T;Y=C,T;N=A,C,G,T.

表2 各組兔HEV定量PCR引物的基本參數(shù)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以構(gòu)建好的A、B、C組的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)模板的實時PCR擴(kuò)增曲線，根據(jù)所得到的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增曲線，以循環(huán)數(shù)閾值為橫軸，以質(zhì)?？截悢?shù)的常用對數(shù)(log10C)為縱軸，利用最大二階導(dǎo)數(shù)法擬合各組標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程，用建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量標(biāo)本中的HEV RNA的含量。由表3可見，A、B、C組的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增效率分別為1.922、1.947、1.942，斜率分別為-3.526、-3.455、-3.469；表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，各個稀釋度相關(guān)性好，誤差較??；可用于樣品中HEV RNA拷貝數(shù)的檢測。

2.3 標(biāo)本檢出率的比較 用以上3組引物及相應(yīng)的探針，平行檢測49份兔糞便標(biāo)本和44份兔血清標(biāo)本，其中糞便標(biāo)本，A、B、C組分別檢出33、33、28份，平均HEV RNA(log copies/g)拷貝數(shù)為6.18、5.90、6.11；血清標(biāo)本，A、B、C組分別檢出29、25、22份，平均HEV RNA(log copies/ml)拷貝數(shù)為3.62、3.43、3.03；各檢測方法間的差異比較，采用配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示：糞便標(biāo)本，A與B、A與C、B與C的P值分別為0.49、0.68、0.37，各組間的P值均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義；血清標(biāo)本，A與B、A與C、B與C的P值分別為0.26、0.01、0.14，其中只有A與C的P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組差異由表4可知，無論是檢測糞便標(biāo)本還是血清標(biāo)本，組內(nèi)的差異均較小(CV<3.5%)，表明這3組TaqMan熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復(fù)性，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表3 各組標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)

表4 糞便、血液標(biāo)本HEV RNA的檢測結(jié)果

Note:a[F(S)], fecal (serum) samples;bMean standard deviation;ccoefficient of variation.

用A、B、C三組引物、探針檢測糞便標(biāo)本，其HEV RNA陽性率分別為67.35%(33/49)、67.35%(33/49)、57.14%(28/49)；血清標(biāo)本的陽性率分別為65.90%(29/44)、56.82%(25/44)、50.00%(22/44)。結(jié)果表明，無論是糞便標(biāo)本還是血清標(biāo)本，使用A組引物、探針，RNA的檢出率均高于另外兩組；此外，糞便標(biāo)本中的HEV RNA檢出率均高于血清中的檢出率。

2.4 不同HEV病毒株檢出率的比較 為進(jìn)一步驗證本實驗所設(shè)計的探針及引物對兔HEV RNA檢測的有效性，又用A、B、C三組引物、探針平行檢測了另外30份接種了不同HEV病毒株的兔糞便標(biāo)本，其中20份為接種過兔HEV(GDC9株、rbIM004株各10份，GenBank登錄號分別為：FJ906895、AB740222)，10份為接種過豬HEV基因4型(CH-YT-1株 GenBank登錄號：KC163335.1)。由表5可知，A、B、C組的定量方法均可適用于不同兔HEV病毒株的檢測，其中A、B、C組分別檢出19、17、15份陽性標(biāo)本，各組內(nèi)兔、豬HEV RNA的檢出情況分別為：A組14、5份，B組14、3份，C組12、3份。以上結(jié)果表明，新建立的B、C兩組探針、引物對兔HEV RNA檢出率均高于對豬HEV RNA的檢出率，進(jìn)一步提示這兩組探針、引物可有效的用于不同兔HEV分離株的檢測及定量 。此外，我們還進(jìn)一步采用Fisher確切概率法對這3組陽性檢出率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，A與B組、A與C組、B與C組P值均小于0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明對于上述不同HEV分離株的檢測，A組要優(yōu)于另外兩組。

表5 其它糞便標(biāo)本HEV RNA的檢測結(jié)果

Note: G*, GDC9 fecal samples; R#, rbIM004 fecal samples; Y△, CH-YT-1 fecal samples.

3 討 論

目前對于HEV感染的檢測大多是基于免疫酶學(xué)法檢測血清抗-HEV抗體和RT-nPCR檢測HEV RNA，但由于至今尚無穩(wěn)定有效的統(tǒng)一檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)，不同批次、不同生產(chǎn)廠家的檢測試劑盒，其靈敏度、特異性等不盡相同。而常規(guī)檢測HEV的RT-PCR法是一種定性的檢測，存在易污染、較費時、無法確定病毒載量等問題。因此，各國學(xué)者開始嘗試更為高效、快速的實時熒光定量PCR方法來檢測HEV。美國和法國學(xué)者分別以HEV的ORF2、ORF3片段中的保守區(qū)設(shè)計相應(yīng)的特異性探針和引物檢測了G1～G4型HEV及豬HEV，其特異性和靈敏度具有較好的相關(guān)性，其研究還進(jìn)一步提示，對于G3型HEV，采用ORF3片段保守區(qū)設(shè)計的探針和引物具有較高的靈敏度和特異性[19-21]。此外，還有一些其它研究，以O(shè)RF1片段保守區(qū)所設(shè)計引物和探針來檢測HEV，同樣也獲得了較好靈敏度和特異性[19]。但對于近年來頗受關(guān)注的兔HEV，其相關(guān)的定量方法尚未見報道，而且上述研究者們采用的引物和探針都是基于G1～G4 HEV和豬HEV序列所設(shè)計的。因此本實驗分別以兔HEV的ORF1、ORF3片段設(shè)計了2套新的探針和引物(B、C組)，并和Jothikumar N等的(A組)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，對于糞便標(biāo)本，A、B、C組均具有較好的檢出率，而對于血液標(biāo)本，A組的檢出率為65.9%，明顯高于另外兩組，推測可能原因：一是糞便標(biāo)本中的HEV RNA 的載量可能高于血液[20]，二是當(dāng)HEV RNA載量較低時，可能低于B、C組的檢測下限；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這3組定量檢測方法在糞便標(biāo)本中的檢出率均高于血液標(biāo)本的檢出率，其中糞便標(biāo)本的陽性率分別為67.35%、67.35%、57.14%；血清標(biāo)本的為65.90%、56.82%、50.00%，這一結(jié)果也符合以往的報道，即HEV的感染是一急性自限性的過程，病毒血癥的持續(xù)時間要短于糞便排毒的持續(xù)時間[22]。

本研究結(jié)果提示Jothikumar N等所報道的HEV RNA檢測方法也同樣適用于兔HEV RNA的定量檢測，同時本研究中新設(shè)計的兩套TaqMan探針、引物也同樣適用于兔HEV RNA的定量檢測，但對于檢測一些病毒載量較低的標(biāo)本時，建議首選Jothikumar N等所報道的檢測方法，其引物和探針均是在ORF2/ORF3的重疊區(qū)設(shè)計，這可能與其擴(kuò)增片段的保守性有關(guān)，值得注意的是本實驗中設(shè)計的B組引物和探針也是位于HEV基因組的ORF2/ORF3的重疊區(qū)，但隨著越來越多的兔HEV病毒株的被發(fā)現(xiàn)，這一重疊區(qū)的基因組并非如以往所報道的那么保守[23]，因此在本實驗前期設(shè)計引物和探針的過程中，在上、下游引物的序列中插入了一些簡并堿基，這可能會影響到PCR擴(kuò)增中的退火過程，這也進(jìn)一步解釋了B、C組定量PCR法在檢測血液樣本時，陽性檢出率低于A組的原因，但是就總的檢出率而言，本研究所設(shè)計的引物和探針(B、C組)與通用引物(A組)無統(tǒng)計學(xué)差異。

迄今，熒光定量PCR是國際公認(rèn)的核酸定量的標(biāo)準(zhǔn)方法[24]，不同實驗室間的結(jié)果可以相互進(jìn)行比較。該方法雖然診斷結(jié)果較為準(zhǔn)確，但由于絕對標(biāo)準(zhǔn)品的制備比較困難，而且技術(shù)水平要求較高，在實際生產(chǎn)中難以推廣應(yīng)用，因此本實驗研究采用了質(zhì)粒法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，這一方法不僅相對簡單而且費用小、耗時少，能夠快速簡便在一些科研院所中廣泛推廣。此外也有一些研究者，用酶切的方法將構(gòu)建好的環(huán)狀質(zhì)粒線性化，用線性質(zhì)粒來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線等[25]。最近WHO也建立了標(biāo)準(zhǔn)的HEV核酸絕對定量方法，制備了標(biāo)準(zhǔn)化的不同濃度梯度的絕對標(biāo)準(zhǔn)品[26]，這使得HEV核酸的定量檢測更加標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)一化。

綜上所述，本實驗新建立了兩套針對于兔HEV定量的TaqMan探針、引物，并采用質(zhì)粒法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，該法操作簡單、省時、經(jīng)濟(jì)易于推廣應(yīng)用，且與使用Jothikumar N等所報道的通用型引物及TaqMan探針檢測結(jié)果無明顯差異。雖然兔HEV具有獨特的基因結(jié)構(gòu)，但本實驗研究表明，使用Jothikumar N等所報道的通用型引物及TaqMan探針檢測不影響檢出率。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，我們相信在未來，HEV的定量檢測會越來越精確、廉價、便捷。

[1]Tam AW, Smith MM, Guerra ME, et al. Hepatitis E virus (HEV): molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome[J]. Virology, 1991, 185(1): 120-131. DOI: 10.1016/0042-6822(91)90760-9

[2]Fujiwara S, Yokokawa Y, Morino K, et al. Chronic hepatitis E: a review of the literature[J]. J Viral Hepat, 2014, 21(2): 78-89. DOI: 10.1111/jvh.12156

[3]Haqshenas G, Shivaprasad HL, Woolcock PR, et al. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis-splenomegaly syndrome in the United States[J]. J Gen Virol, 2001, 82(Pt 10): 2449-2462.

[4]Nakamura M, Takahashi K, Taira K, et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence[J]. Hepatol Res, 2006, 34(3): 137-140. DOI: 10.1016/j.hepres.2005.10.010

[5]Tomiyama D, Inoue E, Osawa Y, et al. Serological evidence of infection with hepatitis E virus among wild Yezo-deer, Cervus nippon yesoensis, in Hokkaido, Japan[J]. J Viral Hepat, 2009, 16(7): 524-528. DOI: 10.1111/j.1365-2893.2009.01107.x

[6]Johne R, Heckel G, Plenge-Bonig A, et al. Novel hepatitis E virus genotype in Norway rats, Germany[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(9): 1452-1455. DOI: 10.3201/eid1609.100444

[7]Batts W, Yun S, Hedrick R, et al. A novel member of the family Hepeviridae from cutthroat trout (Oncorhynchusclarkii)[J]. Virus Res, 2011, 158(1-2): 116-123. DOI: 10.1016/j.virusres.2011.03.019

[8]Takahashi M, Nishizawa T, Sato H, et al. Analysis of the full-length genome of a hepatitis E virus isolate obtained from a wild boar in Japan that is classifiable into a novel genotype[J]. J Gen Virol, 2011, 92(Pt 4): 902-908. DOI: 10.1099/vir.0.029470-0

[9]Raj VS, Smits SL, Pas SD, et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(8): 1369-1370. DOI: 10.3201/eid1808.111659

[10]Bodewes R, van der Giessen J, Haagmans BL, et al. Identification of multiple novel viruses, including a parvovirus and a hepevirus, in feces of red foxes[J]. J Virol, 2013, 87(13): 7758-7764. DOI: 10.1128/JVI.00568-13

[11]Woo PC, Lau SK, Teng JL, et al. New hepatitis E virus genotype in camels, the Middle East[J]. Emerg Infect Dis, 2014, 20(6): 1044-1048. DOI: 10.3201/eid2006.140140

[12]Zhao C, Ma Z, Harrison TJ, et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China[J]. J Med Virol, 2009, 81(8): 1371-1379. DOI: 10.1002/jmv.21536

[13]Cossaboom CM, Cordoba L, Dryman BA, et al. Hepatitis E virus in rabbits, Virginia, USA[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(11): 2047-2049. DOI: 10.3201/eid1711.110428

[14]Izopet J, Dubois M, Bertagnoli S, et al. Hepatitis E virus strains in rabbits and evidence of a closely related strain in humans, France[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(8): 1274-1281. DOI: 10.3201/eid1808.120057

[15]Liu P, Bu QN, Wang L, et al. Transmission of hepatitis E virus from rabbits to cynomolgus macaques [J]. Emerg Infect Dis, 2013, 19(4): 559-565. DOI: 10.3201/eid1904.120827

[16]Vollmer T, Knabbe C, Dreier J. Comparison of real-time PCR and antigen assays for detection of hepatitis E virus in blood donors[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52(6): 2150-2156. DOI: 10.1128/JCM.03578-13

[17]Jothikumar N, Cromeans TL, Robertson BH, et al. A broadly reactive one-step real-time RT-PCR assay for rapid and sensitive detection of hepatitis E virus[J]. J Virol Methods, 2006, 131(1): 65-71. DOI: 10.1016/j.jviromet.2005.07.004

[18]Gerber PF, Xiao CT, Cao D, et al. Comparison of real-time reverse transcriptase PCR assays for detection of swine hepatitis E virus in fecal samples[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52(4): 1045-1051. DOI: 10.1128/JCM.03118-13

[19]Abravanel F, Sandres-Saune K, Lhomme S, et al. Genotype 3 diversity and quantification of hepatitis E virus RNA[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(3): 897-902. DOI: 10.1128/JCM.05942-11

[20]Enouf V, Dos RG, Guthmann JP, et al. Validation of single real-time TaqMan PCR assay for the detection and quantitation of four major genotypes of hepatitis E virus in clinical specimens[J]. J Med Virol, 2006, 78(8): 1076-1082. DOI: 10.1002/JMV.20665

[21]Baylis SA, Hanschmann KM, Blumel J, et al. Standardization of hepatitis E virus (HEV) nucleic acid amplification technique-based assays: an initial study to evaluate a panel of HEV strains and investigate laboratory performance[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(4): 1234-1239. DOI: 10.1128/JCM.02578-10

[22]Hoofnagle JH, Nelson KE, Purcell RH. Hepatitis E[J]. N Engl J Med, 2012, 367(13): 1237-1244.DOI: 10.1056/NEJMra1204512

[23]Inoue J, Takahashi M, Yazaki Y, et al. Development and validation of an improved RT-PCR assay with nested universal primers for detection of hepatitis E virus strains with significant sequence divergence[J]. J Virol Methods, 2006, 137(2): 325-333. DOI: 10.1016/j.jviromet.2006.07.004

[24]Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Res, 1996, 6(10): 986-994. DOI: 10.1101/gr.6.10.986

[25]Li L, Zhao CP, Li H, et al. Establishment of the plasmid standard curve generation method for absolute quantification PCR[J]. J Agr Biotechnol, 2011, 19(06): 1157-1162. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968 (in Chinese) 李麗，趙成萍，李宏，等. 質(zhì)粒制備絕對定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方法的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2011, 19(6):1157-1162. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968

[26]Baylis SA, Blumel J, Mizusawa S, et al. World Health Organization International Standard to harmonize assays for detection of hepatitis E virus RNA[J]. Emerge Infect Dis, 2013, 19(5): 729-735. DOI: 10.3201/eid1905.121845

Detection and evaluation of rabbit HEV by quantitative real-time PCR

ZENG Hang,ZHANG Yu-lin,WANG Lin,LIU Peng,WANG Ling

(DepartmentofMicrobiologyInfectiousDiseaseCenter,SchoolofBasicMedicalSciences,PekingUniversity,Beijing100191,China)

In order to improve the detection rate for rabbit HEV RNA, specific primers and TaqMan probes were designed and evaluated in this study. Fourteen complete genome sequences of rabbit HEV isolates downloaded from GenBank were aligned to get the conserved areas in ORF1 and ORF3. Subsequently, TaqMan probes and pairs of primers were designed and synthesized according to the conserved areas respectively. The probe and primers for ORF1 were named as group C and ORF3 as group B, while those had been reported by Jothikumar N were named as group A. Then three groups of different serial 10-fold dilutions of standard plasmid stocks were constructed. The standard curves were generated, and then 49 feces and 44 sera collected from rabbits were tested by the three groups of probes and primers. The results were compared and analyzed. Two newly-designed TaqMan probes and primers for rabbit HEV detection were established and the slopes of the standard curves were -3.455 and -3.469. The positive rates of the three groups (A, B and C) for detection of the 49 rabbit feces were 67.35% (33/49), 67.35% (33/49), 57.14% (28/49) and the mean viral load of HEV RNA (log copies/g) was 6.18, 5.90 and 6.11, respectively. In addition, the positive rates of serum HEV RNA were 65.90% (29/44), 56.82% (25/44) and 50.00% (22/44) and the mean viral load of HEV RNA (log copies/mL) was 3.62, 3.43 and 3.03. Though varied in genomic structure, the application of universal TaqMan probes and primers for rabbit HEV detection does not affect its results.

rabbit HEV; TaqMan probe; primers; quantitative real-time PCR

國家自然科學(xué)基金資助項目(81271827)；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20120001110098)

王玲，Email: lingwang@bjmu.edu.cn

北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系和感染病中心，北京 100191

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.004

R373.2

A

1002-2694(2015)07-0612-06

2015-01-15；

2015-06-04