錢(qián)明明，許海燕，宗 晴，陰甜甜，楊文彬，宋召軍，黃金林，焦新安

常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)GⅠ、GⅡ型諾如病毒方法的建立及其應(yīng)用

錢(qián)明明1，許海燕2，宗 晴1，陰甜甜1，楊文彬1，宋召軍1，黃金林1，焦新安1

目的 建立GI、GII型諾如病毒的常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)兩種方法進(jìn)行應(yīng)用。方法 優(yōu)化篩選出最佳PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，并從靈敏性、特異性、臨床樣品檢測(cè)等方面對(duì)建立的方法進(jìn)行比較與評(píng)價(jià)。結(jié)果 該兩種方法特異性強(qiáng)，與札幌病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒同時(shí)檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng)，同一體系內(nèi)GI、GII型諾如病毒相互之間沒(méi)有干擾；常規(guī)RT-PCR最低檢測(cè)限為103copies/μL，熒光定量RT-PCR最低檢測(cè)限為102copies/μL；對(duì)180份臨床糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，常規(guī)RT-PCR則檢測(cè)率為5.56%(10/180)，符合率達(dá)97.22%，熒光定量RT-PCR檢測(cè)率為8.33%(15/180)，符合率達(dá)100%；對(duì)15份陽(yáng)性樣品測(cè)序分析，證實(shí)均為諾如病毒。結(jié)論 建立的常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR均可用于諾如病毒的快速檢測(cè)，熒光定量RT-PCR更為靈敏。

常規(guī)RT-PCR；熒光定量RT-PCR；GI、GII型諾如病毒

諾如病毒(Norovirus，NVs)屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體，世界50%以上的胃腸炎暴發(fā)均由它引起[1]。根據(jù)病毒RNA聚合酶和衣殼蛋白核苷酸序列的差異，諾如病毒分為5個(gè)基因型，其GI、GII型諾如病毒是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的基因型，在全球都有其流行擴(kuò)散的報(bào)道[2-3]，我國(guó)病人感染的諾如病毒也是以GI、GII型為主[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)由諾如病毒引起的急性胃腸炎疫情的報(bào)道逐漸增多[5]，日益成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，建立快速、特異、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)該病的防控具有重要意義。

由于諾如病毒尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，也缺乏相應(yīng)的動(dòng)物模型，變異多，鑒別和檢測(cè)非常困難，傳統(tǒng)的免疫學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)方法存在很大的局限性[6]。隨著大量諾如病毒全基因及部分序列的測(cè)定與分析，分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于其診斷和研究[7]。本研究建立檢測(cè)GI、GII型諾如病毒的常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法，并應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)，對(duì)兩種方法進(jìn)行比較分析，為進(jìn)一步完善諾如病毒的檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品的采集與處理 180份臨床樣品采集于揚(yáng)州市人民醫(yī)院腹瀉病人的糞便樣品，并用PBS制成10%的糞便懸液，保存于-70℃以備用。

1.2 主要試劑與儀器 TIANamp Virus RNA Kit(TIANGEN公司，貨號(hào)：DP315-R)，PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司，貨號(hào)：RR037A)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BIO公司)，ABI 7500熒光PCR儀(ABI公司)。

1.3 引物與探針 引物及探針序列如下表[8-9]，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR用的引物與探針

1.4 病毒RNA提取及cDNA合成 用TIANamp Virus RNA Kit提取病毒RNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)；提取的RNA用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5 常規(guī)RT-PCR方法的建立

1.5.1 PCR體系與條件 采用正交設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)選最佳PCR反應(yīng)體系，同時(shí)優(yōu)選最佳退火溫度。優(yōu)化后的PCR體系為25 μL，其組分為：2.5 μL 10×PCR Buffer，0.5U Taq酶，上、下游引物各1.25 μL，3.0 μL dNTP，3.0 μL cDNA，用滅菌蒸餾水補(bǔ)足到25 μL體積；優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸10 min。

1.5.2 靈敏性、特異性試驗(yàn) 用分光光度計(jì)對(duì)陽(yáng)性GI、GII型諾如病毒樣品提取的RNA進(jìn)行定量，10倍梯度稀釋病毒液，運(yùn)用建立的RT-PCR對(duì)100～105copies/μL的GI、GII型諾如病毒進(jìn)行檢測(cè)，分析其最低檢測(cè)限；同時(shí)對(duì)GI、GII型諾如病毒、札幌病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。

1.6 熒光定量RT-PCR方法的建立

1.6.1 PCR體系與條件 采用矩陣法優(yōu)選最佳熒光定量PCR反應(yīng)體系。優(yōu)化后的PCR體系為20 μL，其組分為：10 μL 2×Premix Ex Taq，0.4 μL 50×Rox Reference DyeⅡ，上、下游引物各1.6 μL，探針0.8 μL，2.0 μL模板cDNA，用RNase free Water補(bǔ)足至20 μL體積；反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)；在60 ℃收集熒光信號(hào)。

1.6.2 GI、GII型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用于制作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品為含有GI、GII型諾如病毒目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒，紫光分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并根據(jù)質(zhì)粒分子量及阿佛伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)。將質(zhì)粒進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)蚕♂?個(gè)梯度，分別為101～108copies/μL，每個(gè)梯度分別用熒光PCR進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)收集熒光信號(hào)的CT值，繪制出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 靈敏性、特異性試驗(yàn) 運(yùn)用建立的熒光定量RT-PCR對(duì)100～105copies/μL的GI、GII型諾如病毒進(jìn)行檢測(cè)，分析其最低檢測(cè)限；同時(shí)對(duì)GI、GII型諾如病毒、札幌病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。

1.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別選取3個(gè)不同稀釋梯度的GI、GII型諾如病毒進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋梯度平行重復(fù)5次，1周重復(fù)3次，計(jì)算各稀釋梯度CT值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)，以評(píng)價(jià)其批內(nèi)、批間重復(fù)性。

1.7 臨床樣品的檢測(cè) 用建立的兩種方法對(duì)180份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，檢出的陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證兩種方法對(duì)臨床樣品中諾如病毒的準(zhǔn)確檢測(cè)能力。

1.8 數(shù)據(jù)分析 檢出的敏感度、特異度和符合率分別按下列公式進(jìn)行計(jì)算。

敏感度=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))

特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))

符合率=(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù))/被檢總數(shù)

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)RT-PCR靈敏性、特異性試驗(yàn) 靈敏性試驗(yàn)如圖1所示，105、104、103copies/μL的GI、GII型諾如病毒均擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，即最低檢測(cè)限為103copies/μL。特異性試驗(yàn)如圖2所示，分別在相應(yīng)的位置顯示出相應(yīng)的目的條帶，而其他4株腸道病毒均沒(méi)擴(kuò)增出目的條帶，且GI、GII型諾如病毒也沒(méi)交叉反應(yīng)，說(shuō)明該方法具有良好的特異性。

2.2 熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 如圖3所示，GI、GII型諾如病毒在102～108copies/μL范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系，以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，得到GI型的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=40.585-3.301×logX，R2=0.997，擴(kuò)增效率100.889%；GII型的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=40.666-3.229×logX，R2=0.996，擴(kuò)增效率104.039%。

M: DNA marker; 1-6: Norovirus GI (GII) from 105to100copies per reaction; 7: Negative control.

圖1 常規(guī)RT-PCR對(duì)GI(A)、GII(B)型諾如病毒檢測(cè)的靈敏性

Fig.1 Detection limit of conventional RT-PCR for NVs GI(A) and GII(B)

M: DNA marker; 1-6: Norovirus GI, Norovirus GII, Sapporovirus, Rotavirus, Stellatevirus, Adenovirus; 7: Negative control.

圖2 常規(guī)RT-PCR對(duì)GI(A)、GII(B)型諾如病毒檢測(cè)的特異性

Fig.2 Detection specificity of conventional RT-PCR for NVs GI(A) and GII(B)

圖3 GI(A)、GII(B)諾如病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 熒光定量RT-PCR靈敏性、特異性試驗(yàn) 靈敏性試驗(yàn)如圖4顯示，105、104、103、102copies/μL的GI、GII型諾如病毒均得到相應(yīng)良好的擴(kuò)增曲線，即最低檢測(cè)限為102copies/μL；特異性試驗(yàn)如圖5顯示，GI、GII型諾如病毒經(jīng)熒光定量PCR擴(kuò)增后，分別有相應(yīng)的熒光擴(kuò)增曲線，而其他4株腸道病毒均沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生，且GI、GII型諾如病毒也沒(méi)交叉反應(yīng)，表明其所用引物和探針具有良好的特異性。

From left to right: 105-100copies/μL for NVs GI and GII and negative control.

圖4 熒光定量RT-PCR對(duì)GI(A)、GII(B)型諾如病毒檢測(cè)的靈敏性

Fig.4 Detection limit of real-time RT-PCR for NVs GI(A) and GII(B)

From left to right: Norovirus GI, Norovirus GII, Sapporovirus, Rotavirus, Stellatevirus, Adenovirus, negative control.

圖5 熒光定量RT-PCR對(duì)GI(A)、GII(B)型諾如病毒檢測(cè)的特異性

Fig.5 Detection specificity of real-time RT-PCR for NVs GI(A) and GII(B)

2.4 熒光定量RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表2，同一批次內(nèi)GI、GII型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)差在0.040～0.137范圍內(nèi)，變異系數(shù)在0.18%～0.57%之間；不同批次間GI、GII型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)差在0.138～0.675范圍內(nèi)，變異系數(shù)在0.71%～2.62%之間，由此證明此方法具有良好的批內(nèi)、批間重復(fù)性。

表2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)GI、GII型諾如病毒的重復(fù)性

2.6 常規(guī)RT-PCR法與熒光定量RT-PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)及比較 180份臨床樣品中，常規(guī)RT-PCR檢測(cè)率為5.56%(10/180)，熒光定量RT-PCR檢測(cè)率為8.33%(15/180)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法的檢測(cè)率有顯著差異(P<0.05)；計(jì)算可知，常規(guī)RT-PCR敏感度、特異度分別為66.67%、97.06%，符合率達(dá)到97.22%；而熒光定量RT-PCR敏感度、特異度和符合率均達(dá)到100%(見(jiàn)表3)；對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證實(shí)均為諾如病毒。

3 討 論

諾如病毒是引起人類(lèi)非細(xì)菌性胃腸炎的重要病原體，主要通過(guò)污染的食物和水源傳播，侵染力強(qiáng)，感染劑量可低至10～100病毒粒子，傳播迅速，極易引起暴發(fā)。因此對(duì)該病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的定性、定量監(jiān)測(cè)，對(duì)預(yù)防疫情暴發(fā)具有重要的意義。

目前，檢測(cè)諾如病毒的方法有電鏡法、免疫法和分子生物學(xué)等方法，電鏡法是最早的檢測(cè)方法，但靈敏度低，而且樣品處理過(guò)程復(fù)雜、技術(shù)要求高，不利于臨床應(yīng)用。免疫法應(yīng)用比較多的是酶聯(lián)免疫法，雖快速靈敏，但假陽(yáng)性率高，檢出率低。而以RT-PCR為主的分子生物學(xué)檢測(cè)方法因準(zhǔn)確、快速、特異性好、靈敏度高而被廣泛應(yīng)用。由于諾如病毒極易發(fā)生變異，存在型別眾多，其中引起人類(lèi)感染的GI、GII型諾如病毒至少可分為14和17個(gè)基因亞型[10]，因此引物設(shè)計(jì)是RT-PCR檢測(cè)諾如病毒的關(guān)鍵因素。有研究對(duì)目前國(guó)內(nèi)外常規(guī)RT-PCR檢測(cè)諾如病毒中應(yīng)用的8對(duì)引物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Kojima等[8]針對(duì)諾如病毒衣殼蛋白保守區(qū)的基因序列設(shè)計(jì)的引物GI-SKF/GI-SKR、GII-SKF/GII-SKR是檢測(cè)諾如病毒的理想引物。此外，近年發(fā)展起來(lái)的熒光定量RT-PCR技術(shù)不僅能完成定性檢測(cè)，還可進(jìn)行定量分析，逐步成為病毒檢測(cè)的常用方法。Kageyama等[9]針對(duì)諾如病毒ORF1-ORF2連接處的高度保守區(qū)的基因序列設(shè)計(jì)引物COG1F/COG1R、COG2F/COG2R和探針，對(duì)于電鏡觀察為陽(yáng)性諾如病毒的樣品，該引物的檢測(cè)靈敏度高達(dá)99%，是目前文獻(xiàn)報(bào)道靈敏度較高的引物。

表3 常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的比較

本研究建立的常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR方法均具有良好的特異性，常規(guī)RT-PCR檢測(cè)限為103copies/μL，熒光定量RT-PCR比其靈敏10倍。有研究認(rèn)為采用一步法熒光定量RT-PCR，省去體外逆轉(zhuǎn)錄步驟，可大大提高其檢測(cè)效率。本研究建立的二步法熒光定量RT-PCR，其靈敏性與王毅謙等[11]利用Allglo探針建立的一步法雙重?zé)晒釸T-PCR相當(dāng)，比周冬梅等[12]建立的二步法雙重?zé)晒釸T-PCR高1個(gè)數(shù)量級(jí)。運(yùn)用建立的兩種方法對(duì)180份臨床樣品進(jìn)行同步檢測(cè)，常規(guī)RT-PCR檢出率為5.56%，熒光定量RT-PCR檢出率為8.33%，統(tǒng)計(jì)分析后者檢出率顯著高于前者(P<0.05)，對(duì)檢出的陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為諾如病毒，表明該兩種方法均具有準(zhǔn)確的檢測(cè)能力。并且常規(guī)RT-PCR方法的敏感度、特異度分別為66.67%、97.06%，符合率達(dá)到97.22%，而熒光定量RT-PCR方法的敏感度、特異度、檢測(cè)率要高于常規(guī)RT-PCR，均可達(dá)到100%。此外，對(duì)于熒光定量RT-PCR檢測(cè)CT值在30以?xún)?nèi)的陽(yáng)性樣品，常規(guī)RT-PCR的檢出率為100%，當(dāng)CT值大于30的陽(yáng)性樣品時(shí)，常規(guī)RT-PCR未能檢測(cè)出，表明常規(guī)RT-PCR對(duì)病毒量大的臨床樣品能有效地進(jìn)行檢測(cè)，但熒光定量RT-PCR敏感性更高，對(duì)于諾如病毒的檢測(cè)，建議首選熒光定量RT-PCR，以免發(fā)生漏檢的情況。

本研究建立的諾如病毒常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT- PCR檢測(cè)方法，具有良好的靈敏性、特異性和重復(fù)性，且能快速區(qū)分GI、GII兩種感染人類(lèi)的重要型別，對(duì)諾如病毒感染的快速分型有著實(shí)際意義。其中熒光定量RT-PCR方法不僅能定性檢測(cè)諾如病毒，還能定量分析，這對(duì)于致病劑量和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的后期研究有著重要的意義。省去體外逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，實(shí)現(xiàn)一步法熒光定量RT-PCR，是否更能提高本研究建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)靈敏度，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Establishment of conventional RT-PCR and real-time RT-PCR to detect norovirus and its application

QIAN Ming-ming1,XU Hai-yan2,ZONG Qing1,YIN Tian-tian1,YANG Wen-bin1,SONG Zhao-jun1,HUANG Jin-lin1,JIAO Xin-an1

(1.KeyLaboratoryofZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;2.NantongCenterforDiseaseControlandPrevention,Nantong226000,China)

We established conventional RT-PCR and real-time RT-PCR methods for the detection of norovirus GI and GII. The PCR system and reaction conditions were optimized so that conventional RT-PCR and real-time RT-PCR method were established, the sensitivity, specificity and the detection of clinical stool specimens of these two methods were compared and evaluated. Results showed that the two methods possessed high specificity for norovirus, without any evident cross-reaction with each other or with other enteric viruses, including Sapporovirus, Rotavirus, Stellatevirus and Adenovirus; the detection limit of conventional RT-PCR was 103copies/μL, while the detection limit of real-time RT-PCR was 102copies/μL; the two methods were detected of 180 clinical stool specimens for norovirus; the positive rate for conventional RT-PCR was 5.56% (10/180), the coincidence rate was 97.22%; the positive rate for real-time RT-PCR was 8.33% (15/180), and the coincidence rate was 100%; 15 positive samples were conducted the sequencing analysis and it was confirmed that all of them were norovirus. The two methods were established in this study, which were used in the rapid detection of norovirus, while real-time RT-PCR was more sensitive than conventional RT-PCR.

conventional RT-PCR; real-time RT-PCR; norovirus GI and GII

Huang Jin-lin, Email: jinlin@yzu.edu.cn

黃金林，Email:Jinlin@yzu.edu.cn

1.揚(yáng)州大學(xué)人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009； 2.南通市疾病預(yù)防控制中心，南通 226000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.002

R450

A

1002-2694(2015)07-0602-05

2014-11-05；

2015-05-10

國(guó)家“863計(jì)劃”(2012AA101601)

Supported by the National Programs for High Technology Research and Development of China (No. 2012AA101601)