肖 寒,方 倩

珠海市恙蟲病東方體基因型研究

肖 寒,方 倩

目的 對廣東省珠海市恙蟲病東方體進行基因分型。方法 予高熱期恙蟲病患者靜脈采血后，立刻床旁小白鼠腹腔接種，待發(fā)病后解剖，取其腹壁刮液涂片、吉姆薩染色鏡檢；以巢式PCR進行恙蟲病東方體DNA檢測和序列分析，將結(jié)果進行同源性分析。結(jié)果 床旁小白鼠腹腔接種，腹壁刮液涂片鏡檢可見紫紅色圓形、橢圓形、短桿狀恙蟲病東方體菌體。10例恙蟲病患者進行特異性的巢式PCR擴增，其中6例擴增出目的基因片段，陽性率為60%。將擴得珠海恙蟲病東方體基因片段的DNA序列與基因庫序列進行比對，發(fā)現(xiàn)其與韓國株Yonchon株同源性最高,大于95%，系統(tǒng)進化樹顯示其與Karp株在同一分支。結(jié)論 珠海市為恙蟲病的自然疫源地，該地區(qū)恙蟲病東方體的基因型與Yonchon株最相近。

恙蟲病;病原體分離；基因分型

Funded by the projet of Zhuhai Health Bureau (No. 2011077)

恙蟲病(Scrub typhus)，又名叢林斑疹傷寒，是由恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi，Ot)引起的自然疫源性疾病，鼠類為主要傳染源，恙螨為傳播媒介[1]。1930年在日本分離出Ot，首次明確了日本為該病自然疫源地[2]。1948年也在我國廣州首次分離出病原體。1986年以前我國恙蟲病主要流行于海南、廣東、浙江、廣西、云南、四川、湖南、西藏及臺灣等省區(qū)；1990年代以來疫區(qū)迅速擴展先后在江蘇、山西、山東、河南、天津、東北等長江以北地區(qū)發(fā)現(xiàn)了恙蟲病流行[2-3]。由于自然疫源地的地理環(huán)境、季節(jié)流行特點以及恙蟲病東方體基因型不同，各地區(qū)的恙蟲病流行特征亦不相同[4]。因此本試驗通過對廣東省珠海市恙蟲病病原體分離及對其做基因分型，以便為當?shù)貙οx病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 Ot病原體分離[5-6]取高熱期恙蟲病患者外周靜脈血液4～6 mL，分別床旁腹腔接種于4只6周齡小白鼠，每只約腹腔接種0.8～1.2 mL的恙蟲病患者血液。接種后的小白鼠分籠飼養(yǎng)，每隔約3 h觀察一次，觀察約2周。在2周以內(nèi)若有小鼠意外死亡則予以剔除。約接種2周后，小鼠出現(xiàn)蜷縮、弓背、不喜活動、呼吸急促、腹水征等癥狀為發(fā)病。待小鼠發(fā)病后或瀕臨死亡時，予脫頸椎法處死。對小鼠進行無菌解剖后，取其腹腔滲出液、腹壁刮取物等物涂片、吉姆薩染色、鏡檢。

1.2 巢式PCR法檢測恙蟲病患者血液標本中的OtDNA

1.2.1 OtDNA提取 使用生工SK8224 DNA提取試劑盒提取恙蟲病患者全血標本恙蟲病東方體DNA作為模板，針對Ot 56 KD主要表面抗原基因設計引物[7]：第1輪PCR反應引物P1: 5′- TACATTAGCTGCGGGTATGACA-3′P2: 5′- CCAGCATAATTCTTCAACCAAG-3′預計擴增約340 bp 基因片段；第2輪PCR 反應引物P3:5′TAGAGCAGAGCTAGGTGTTATGTA-3′，P4:5′TAGGCATTATAGTAGGCTGAGG-3′,由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。擴增的目的基因片段約180 bp 基因片段。

1.2.2 Ot PCR鑒定 按常規(guī)方法從恙蟲病患者血液標本中提取DNA作為模板。用巢式PCR鑒定。 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 Ot序列測定及分析 將擴增的基因片段送至上海生工公司進行測序。將上述測序陽性結(jié)果與Karp、 Yonchon、Kato、Kawasaki、Kuroki序列進行對比。用DNAstar軟件進行讀取，用DNAstar軟件與各參考株序列進行多重排列、對比并進行同源性分析，同時用DNAstar軟件計算一組序列內(nèi)以及組間基因的進化距離(Evolutionary distances)，采取計算進化的最短長度(minimal evolution)的方法進行系統(tǒng)進化樹的同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 恙蟲病病原體分離 在臨床診斷恙蟲病[1]高熱期患者中，靜脈采取血液標本行床旁小鼠腹腔接種。每份血標本腹腔接種4只小白鼠，共計20只。有10只小白鼠出現(xiàn)明顯的立克次體血癥，表現(xiàn)為：身體蜷縮、弓背，不喜活動、呼吸稍顯急促及明顯的腹水征等。腹壁刮液后吉姆薩染色，顯微鏡下可見分離的恙蟲病病原體，表現(xiàn)為：成堆分布的圓形或橢圓形、短桿狀紫紅色顆粒，如圖1。

2.2 分子生物學檢測 采用巢式PCR對10例已分離出恙蟲病立克次體患者的血液標本進行檢測。結(jié)果6例恙蟲病患者血液標本中擴增出目的基因片段，約140 bp， PCR陽性率為60%。

圖1 感染Ot的小白鼠腹壁刮液吉姆薩染色鏡檢

Fig.1 Microscopic examination of Giemsa staining for wiping liquid from abdominal wall of mice infected withOt

M: 1 kb marker.

圖2 恙蟲病患者血中Ot特異性片段擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(從左向右依次ZH4、ZH5、ZH7、ZH8、M:1kb marker ZH9、ZH10及健康對照1、健康對照2)

Fig.2 Tsutsugamushi disease in blood of the patients withOtspecific amplification products

2.3 序列測定 將目的基因片段測序，與GenBank的恙蟲病東方體國際標準株進行對比。將以上結(jié)果進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果如下：韓國株Yonchon型(U19903)與ZH4、ZH5、ZH7、ZH8同源性最高達到95%以上。系統(tǒng)進化樹也顯示Karp株(M33004)與ZH9、ZH10在同一分支。

3 討 論

針對該抗原生物學分型得到國際公認的恙蟲病東方體有Gilliam、Karp、Kato、TA678、TA686、TA716、TA763、H1877等8個血清型，其中 Karp、Kato、Gilliam 3個血清型作為國際參考株，在我國以Gilliam型為主[1]。恙蟲病東方體的型別不同，存在的毒力不同，臨床表現(xiàn)的輕重亦有不同。目前對恙蟲病病原體的分型方法主要包括：血清學分型與基因分型。賴延東等[8]在國內(nèi)首次實現(xiàn)Sta56全長抗原的重組表達，并對其初步評價了其替代全細胞純化抗原應用于免疫學診斷的價值，為進一步研究Sta56抗原蛋白的作用和實現(xiàn)經(jīng)濟的診斷打下一定基礎。操敏等[9]對恙蟲病東方體Gilliam株56 kD外膜蛋白基因進行原核表達，并對表達產(chǎn)物進行純化，以獲得有生物活性的重組蛋白，用于恙蟲病診斷試劑的研制。劉運囍等[10]從恙蟲病患者皮膚焦痂提取OT-DNA經(jīng)群引物擴增均陽性，探明了恙蟲病患者皮膚焦痂內(nèi)含有恙蟲病東方體DNA，從而證實了患者皮膚焦痂也可以作為分子生物學檢測標本。分子生物學診斷技術(shù)能在體外將特異性DNA序列進行高效擴增，具有特異、敏感、快速等優(yōu)點，從而成為鑒定恙蟲病東方體的重要方法[11]。尤其PCR方法簡單，出結(jié)果快，對結(jié)果解釋的主觀因素少，不需提純，所以一般實驗室均可采用[12]。

圖3 6株Ot Sta56基因序列進化樹分析

由于 Ot表膜蛋白抗原中含量最豐富的是型特異性抗原(Type Special Antigen,TSA)56 kD蛋白，所以Ot型別具有多樣性；56 kD蛋白是一種暴露在菌體表面的外膜蛋白具有高度保守和抗原結(jié)構(gòu)的復雜性等特點，其抗原結(jié)構(gòu)的復雜性決定抗原型別多樣性,該抗原能同群、型特異性單克隆抗體反應，表明其具有群和型的特異性[5]。Ot在逐步的傳播過程中，其基因型別通過不斷的演變與進化，最終某基因型成為某地區(qū)主要的東方體型別(優(yōu)勢株)。珠海市與廣東東部所存在相同的Ot型別，可能是由于兩地地理位置較近、兩地居民往來頻繁、鼠類的流竄導致。本研究對廣東省珠海市恙蟲病東方體進行基因分型，將擴得的珠海市恙蟲病東方體基因片段DNA序列與基因庫序列進行比對，發(fā)現(xiàn)其與韓國株Yonchon株同源性最高，大于95%，系統(tǒng)進化樹顯示其與Karp株在同一分支。

本研究通過從恙蟲病患者血液中分離恙蟲病東方體，進一步證實了珠海市為恙蟲病疫源地。因此在地區(qū)應積極做好必要的預防措施，以降低本病的發(fā)生率。主要包括以下幾個方面[13-14]：①做好滅鼠工作以消滅傳染源;②消滅恙螨切斷傳播途徑：鏟除房屋周圍雜草改善居住環(huán)境衛(wèi)生、減少潮濕增加光照等方法消滅恙螨孳生地；③做好個人防護措施以減少發(fā)病率：禁止在草坪上坐臥，避免在接近樹木及雜草叢等地方晾曬衣物；在流行區(qū)進行野外生產(chǎn)活動或游玩時，應穿長褲、長袖以減少皮膚裸露面積；④由于本病目前尚無有效的疫苗可供使用，對因工作或其他原因而不得不進入重疫區(qū)的人員，可通過預先服強力霉素等藥物達到預感染降低發(fā)病率。

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Genotypes of etiology ofOrientiatsutsugamushiin Zhuhai City, China

XIAO Han,FANG Qian

(DepartmentofInfectiousDiseases,theFifthAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zhuhai563003,China)

The genotyping of disease causedOrientiatsutsugamushiin Zhuhai City, Guangdong Province, China was studied. We inoculated them to the abdominal cavity of laboratory rat immediately after collection of the venous blood of patients during febrile period. The autopsy was made after onset of tsutsugamushi disease followed by microscopic examining of the scraping smear of abdominal wall with Wright Giemsa staining. DNA detection and sequence analysis ofOrientiatsutsugamushiwere resorted to nested PCR. Results were administered by homology analysis. Mice inoculated intraperitoneally were found with purplish red circular, oval and short rod strain ofOrientiatsutsugamushiin abdominal wall by scraping smear microscopic examination. Ten cases of tsutsugamushi disease patients were administered with specific nested PCR amplification, 6 out of which were amplified with target gene fragment with 60% of positive rate. By comparing the amplified DNA sequences with sequences of the gene pool, we found that its homology was the highest with the South Korean Yonchon strains for exceeding 95%. The phylogenetic tree showed that it was in the same branch with the Karp strain. Zhuhai City is natural epidemic area of tsutsugamushi disease, and the genotype ofOrientiatsutsugamushiin this area is the most similar with that of Yonchon strain.

tsutsugamushi disease; pathogen separation; genotyping

遵義醫(yī)學院第五附屬(珠海)醫(yī)院感染科，珠海 563003

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.010

R376

A

1002-2694(2015)02-0139-04

2014-03-27；

2014-05-19

珠海市衛(wèi)生局課題(No.2011077)