屈艷霞，袁玉枝，楊 燁，江 帆，陳桂蘭，辜俊梅，李志華，左連東(.廣州市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所 5040；.廣州市番禺區(qū)人口和計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)站 58000；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州 5050)

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·論 著·

345例αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血血液學(xué)和基因型結(jié)果分析*

屈艷霞1，袁玉枝1，楊 燁1，江 帆1，陳桂蘭1，辜俊梅2，李志華3，左連東1
(1.廣州市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所 510410；2.廣州市番禺區(qū)人口和計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)站 518000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州 510150)

目的 分析廣州地區(qū)αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血的臨床特征、基因突變類型，為臨床遺傳咨詢提供依據(jù)。方法 進(jìn)行血常規(guī)參數(shù)分析，篩查異常者進(jìn)行高效液相色譜分析(HPLC)檢測(cè)，應(yīng)用跨越斷裂點(diǎn)PCR(Gap-PCR)和PCR結(jié)合反向雜交(PCR-RDB)技術(shù)進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因分析。夫婦為同型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者進(jìn)一步行胎兒珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷，產(chǎn)后隨訪。結(jié)果αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者的臨床表現(xiàn)和HPLC結(jié)果，與單純?chǔ)?珠蛋白生成障礙性貧血雜合子攜帶者無(wú)差異；51個(gè)同型珠蛋白生成障礙性貧血家庭，經(jīng)產(chǎn)前基因診斷檢出重型β-珠蛋白生成障礙性貧血4例、重型α-珠蛋白生成障礙性貧血7例，均知情選擇終止妊娠；產(chǎn)后隨訪結(jié)果均與產(chǎn)前診斷結(jié)果相符。結(jié)論 廣州地區(qū)人群αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶率較高，β-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者同時(shí)進(jìn)行α、β基因檢測(cè)，對(duì)準(zhǔn)確地進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷具有重要意義。

α珠蛋白生成障礙性貧血；β珠蛋白生成障礙性貧血； 基因診斷； 產(chǎn)前診斷

珠蛋白生成障礙性貧血是一類由于珠蛋白基因缺失或缺陷使珠蛋白鏈合成受到部分或完全抑制而引起的一組遺傳性溶血性貧血,高發(fā)于地中海地區(qū)、非洲、東南亞及我國(guó)西南、華南一帶。據(jù)報(bào)道廣東、廣西、四川、貴州和臺(tái)灣等地區(qū)人群中α-珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)生率高達(dá)4.20%～17.55%，β-珠蛋白生成障礙性貧血為1.10%～6.43%[1]。在這些珠蛋白生成障礙性貧血高發(fā)區(qū)，αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶率亦較高，Li等[2]報(bào)道廣東省人群中αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血的攜帶率為0.63%。為了解廣州市αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者的發(fā)生率、基因突變類型，并探討預(yù)防重型珠蛋白生成障礙性貧血的有效手段及意義，總結(jié)廣州市4個(gè)區(qū)2007年9月至2014年9月345例αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者的基因診斷及產(chǎn)前基因診斷結(jié)果，進(jìn)行分析如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 廣州市黃埔區(qū)、番禺區(qū)、增城區(qū)、天河區(qū)通過(guò)廣州市免費(fèi)出生缺陷干預(yù)工程[3]共篩查64 200例，其中αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者345例，男性170例，年齡23～39歲、平均(28.35±3.62)歲；女性175例，年齡21～37歲、平均(26.22±3.40)歲。345例αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果又分為β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血1組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血2組和β復(fù)合血紅蛋白H病(HbH病)組。同時(shí)選取200例(男女各100例)血液學(xué)表型正常、且經(jīng)基因檢測(cè)α-及β-珠蛋白生成障礙性貧血均未發(fā)現(xiàn)異常者為對(duì)照組，200例(男女各100例)經(jīng)基因檢測(cè)確診僅攜帶β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變者作為β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子組。所有受試者在2007年9月至2013年2月完成篩查和產(chǎn)前診斷，2014年完成隨訪。所有受試者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血常規(guī)初篩 取外周血2～4 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,應(yīng)用五分類全自動(dòng)血常規(guī)分析儀進(jìn)行血液學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH)等。MCV≤82 fL和(或)MCH≤26 pg為篩查異常，將進(jìn)行高效液相色譜分析(HPLC)檢測(cè)。

1.2.2 HPLC分析 應(yīng)用血紅蛋白自動(dòng)分析儀(Variant Ⅱ,BIO-RAD公司,USA)定量分析血紅蛋白F(HbF)、血紅蛋白A2(HbA2)等。 所有珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽(yáng)性的標(biāo)本均檢測(cè)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因；HbA2≥3.5%和(或)HbF≥2.3%時(shí)，檢測(cè)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因。

1.2.3 基因型鑒定 采用Gap-PCR技術(shù)檢測(cè)3種缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型(--SEA，-α3.7，-α4.2),采用PCR-RDB技術(shù)檢測(cè)非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因3種常見(jiàn)突變類型(αCS,αQS和αWS)和17種β-珠蛋白生成障礙性貧血常見(jiàn)突變類型(CD41-42、CD71-72、CD17、-28、CD26、IVS-Ⅱ-654、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD43、CD31、CD27/28、-32、-29、CD30、CD14-15、CAP和Int)。所有珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷試劑盒購(gòu)買(mǎi)于深圳益生堂生物技術(shù)有限公司。

1.2.4 產(chǎn)前基因診斷 對(duì)于夫婦為同型珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者的孕婦，在其知情同意下統(tǒng)一轉(zhuǎn)診至廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院。孕婦于術(shù)前進(jìn)行遺傳咨詢，簽署產(chǎn)前診斷相關(guān)手術(shù)知情同意書(shū)。在B超引導(dǎo)下，經(jīng)孕婦腹壁行羊膜腔穿刺抽取羊水10 mL(孕18～24周)進(jìn)行胎兒珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷。

1.2.5 隨訪 根據(jù)胎兒珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷結(jié)果，對(duì)所有受檢者進(jìn)行優(yōu)生咨詢和指導(dǎo)。隨訪所有受檢者的妊娠結(jié)局，并于產(chǎn)后3～12個(gè)月對(duì)新生兒進(jìn)行跟蹤隨訪。

2 結(jié) 果

345例受檢者經(jīng)檢測(cè)，其中β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血1組209例，β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血2組130例，β復(fù)合HbH病組6例。

2.1 血液學(xué)指標(biāo) 345例受檢者的血常規(guī)結(jié)果顯示,此類患者多表現(xiàn)為小細(xì)胞、低Hb，MCV降低，MCH降低。Hb結(jié)果顯示，此類患者臨床表現(xiàn)較輕，貧血表現(xiàn)從輕度到正常不等，因此一般不會(huì)引起嚴(yán)重的臨床后果。345例受檢者的血常規(guī)初篩結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血1組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血2組、β復(fù)合HbH病組和β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子組之間Hb、MCV、MCH差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血1組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血2組、β復(fù)合血紅蛋白H病(HbH病)組和β珠蛋白生成障礙性貧血雜合子組之間比較，MCV、MCH水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Hb水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血1組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血2組、β復(fù)合HbH病組分別與β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子組進(jìn)行比較，Hb水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，MCV、MCH水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 345例受檢者的血液學(xué)指標(biāo)結(jié)果分析±s)

2.2 HPLC結(jié)果 345例受檢者中,除6例復(fù)合HbH患者血紅蛋白電泳結(jié)果出現(xiàn)1.4%血紅蛋白CS(HbCS),1.6%血紅蛋白Bart′s(Hb Bart′s)外,其余339例均表現(xiàn)為HbA2升高，胎兒HbF正?；蜉p微升高(1.7%～4.2%)。345例受檢者的HPLC結(jié)果分析見(jiàn)表2。對(duì)照組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血1組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血2組、β復(fù)合HbH病組和β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子組之間HbA2、HbF水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血1組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血2組、β復(fù)合HbH病組和β珠蛋白生成障礙性貧血雜合子組之間比較HbA2、HbF水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血與單純?chǔ)?珠蛋白生成障礙性貧血雜合子的血紅蛋白電泳結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 345例受檢者的HPLC結(jié)果分析±s，%)

2.3 基因檢測(cè)結(jié)果 345例受檢者中,共檢出11種β突變基因類型,分別為CD41-42、IVS-Ⅱ-654、-28、CD17、βE、CD71-72、-29、IVS-Ⅰ-1、CD27-28、CD43和CD14-15突變。其中CD41-42(-CTTT)移碼突變頻率最高，占47.54%(164/345)。共檢出8種α突變,基因型分別為--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/-α3.7、--SEA/-α4.2、-α3.7/-α4.2、ααQS/αα和ααWS/αα,其中--SEA/αα最常見(jiàn),占60.29%(208/345)，6例為HbH病患者(包括4例--SEA/-α3.7和2例--SEA/-α4.2)外,其余均為α-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子。345例受檢者中，5對(duì)夫婦同為αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者，32例配偶為α-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者，14例配偶為β-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者。345例受檢者的基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 產(chǎn)前診斷及隨訪結(jié)果 5個(gè)同為αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者的家庭，46對(duì)夫婦一方為αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血，其配偶為α-珠蛋白生成障礙性貧血或β-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者的家庭，均知情同意進(jìn)行了胎兒珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前基因診斷，其中15例胎兒完全正常，25例為輕型珠蛋白生成障礙性貧血(其中輕型α-珠蛋白生成障礙性貧血14例、輕型β-珠蛋白生成障礙性貧血8例、輕型αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血3例)，11例為重型珠蛋白生成障礙性貧血(重型β-珠蛋白生成障礙性貧血4例、重型α-珠蛋白生成障礙性貧血7例)。對(duì)所有受檢者進(jìn)行了遺傳咨詢，11例檢出重型珠蛋白生成障礙性貧血胎兒的孕婦，在知情同意下選擇了終止妊娠，其余40例均選擇了繼續(xù)妊娠。對(duì)所有受檢者進(jìn)行妊娠結(jié)局的隨訪，并于產(chǎn)后3、12個(gè)月對(duì)新生兒進(jìn)行跟蹤隨訪，結(jié)果均與產(chǎn)前基因診斷結(jié)果相符。

表3 345例αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)結(jié)果(n)

3 討 論

珠蛋白生成障礙性貧血主要分為兩種類型，分別是α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血，相同類型珠蛋白生成障礙性貧血雜合子間的婚配，生育重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的概率為1/4。不同類型珠蛋白生成障礙性貧血(α與β)雜合子婚配，沒(méi)有生育重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的風(fēng)險(xiǎn),但有生育αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血雙重雜合子的可能。這種雙重雜合子本身沒(méi)有嚴(yán)重的臨床表型,但無(wú)論與α或β雜合子婚配,均有可能生育重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒。因此,提高αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血檢出率,對(duì)指導(dǎo)珠蛋白生成障礙性貧血遺傳咨詢和準(zhǔn)確進(jìn)行產(chǎn)前診斷都具有重要意義。

從表型來(lái)看，所有αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血均表現(xiàn)出β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子的特點(diǎn)，即MCV和MCH低于健康人，HbA2增高，而α-珠蛋白生成障礙性貧血的特征被掩蓋，與既往研究報(bào)道一致[4-5]。345例αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血與200例單純?chǔ)?珠蛋白生成障礙性貧血的血液學(xué)指標(biāo)(MCV、MCH)和HPLC結(jié)果(HbA2、HbF)進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明血液學(xué)指標(biāo)和電泳結(jié)果對(duì)αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血的準(zhǔn)確檢出作用都不大。故臨床上αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血容易被漏檢，且多誤診為β珠蛋白生成障礙性貧血，而αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血者與α-珠蛋白生成障礙性貧血或β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子個(gè)體婚配，均有可能生育出中、重型珠蛋白生成障礙性貧血兒。

αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者比單純?chǔ)?珠蛋白生成障礙性貧血雜合子攜帶者的臨床表現(xiàn)輕，本研究中β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血1組、β復(fù)合α珠蛋白生成障礙性貧血2組、β復(fù)合HbH病組分別與β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子組進(jìn)行比較，MCV、MCH均值之間差異均有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。這是由于αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血者同時(shí)存在α及β珠蛋白基因缺陷，導(dǎo)致其α及β珠蛋白鏈的合成均相應(yīng)減少，從而使β/α鏈比例失衡狀態(tài)較單純?chǔ)林榈鞍咨烧系K性貧血或單純?chǔ)轮榈鞍咨烧系K性貧血輕，以至不出現(xiàn)大量多余的β鏈，故其貧血程度也會(huì)有所減輕[6]。

從基因型來(lái)看，β-珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)生的分子基礎(chǔ)主要是由于β珠蛋白基因發(fā)生了突變，使β珠蛋白合成減少。β-珠蛋白生成障礙性貧血在我國(guó)南方以CD41-42、IVS-Ⅱ-654、-28、CD17、βE和CD71-72最為常見(jiàn)。在本研究中上述5種突變類型大約占β-珠蛋白生成障礙性貧血的97.38%，與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相符[7-8]；α-珠蛋白生成障礙性貧血的分子基礎(chǔ)則是α2和α1珠蛋白基因缺失或者發(fā)生點(diǎn)突變，在我國(guó)主要是東南亞缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血1(--SEA)，α-珠蛋白生成障礙性貧血2則多為右側(cè)缺失型(-α3.7)及左側(cè)缺失型(-α4.2)。345例受檢者中，以--SEA/αα最常見(jiàn),占60.29%(208/345)，與其他研究報(bào)道一致[9]。

345例受檢者中，夫婦均為αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者5對(duì)，配偶為α-珠蛋白生成障礙性貧血或β-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者46例。這51例孕婦均知情同意進(jìn)行了胎兒珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前基因診斷，根據(jù)胎兒珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷結(jié)果，對(duì)所有受檢者進(jìn)行了遺傳咨詢。11例檢出為重型珠蛋白生成障礙性貧血胎兒的孕婦均知情選擇了終止妊娠，有效地避免了這些重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生。對(duì)所有受檢者進(jìn)行妊娠結(jié)局的隨訪，并于產(chǎn)后3、12個(gè)月對(duì)新生兒進(jìn)行跟蹤隨訪，結(jié)果均與產(chǎn)前基因診斷結(jié)果相符。

廣州市人群αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血的發(fā)生率較高，且缺乏特異性的血液學(xué)指標(biāo),只能通過(guò)基因分析確診。因此，在臨床工作中一定要加強(qiáng)對(duì)αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血的重視，尤其是對(duì)于配偶已確診為α-珠蛋白生成障礙性貧血的情況下，應(yīng)對(duì)β-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者同時(shí)進(jìn)行α-珠蛋白生成障礙性貧血的基因檢測(cè)，以便進(jìn)行準(zhǔn)確的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，這對(duì)于避免中、重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生具有重要的意義。

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Analysis on hematology and genotypes results in 345 cases of αβ compound thalassemia*

QUYan-xia1,YUANYu-zhi1,YANGYe1,JIANGFan1,CHENGui-lan1,GUJun-mei2,LIZhi-hua3,ZUOLian-dong1
(1.GuangzhouMunicipalInstituteofPopulationandFamilyPlanning,Guangzhou,Guangdong510410,China;2.PanyuDistrictFamilyPlanningServiceStation,Guangzhou,Guangdong518000,China;3.ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510150,China)

Objective To investigate the clinical features and gene mutation types of αβ compound thalassemia to provide the basis for the clinical genetic counseling.Methods The blood routine parameters were analyzed.The individuals with abnormal results were detected by HPLC and the gene analysis of thalassemia was performed by using the gap-polymerase chain reaction(gap-PCR) and PCR combined with the reverse dot blot(PCR-RDB) technology.Husband and wife were the carriers of homotype thalassemia and further performed the gene diagnosis of fetal thalassemia and postpartum follow up.Results The clinical features and the HPLC results in the carriers of αβ compound thalassemia were similar to those of simple β-thalassemia heterozygous carriers.Among 51 families of homotype thalassemia,4 cases of severe β-thalassemia and 7 cases of severe α-thalassemia were detected by prenatal gene diagnosis.All cases selected the pregnancy termination after informing;the postpartum follow-up results were consistent with the prenatal diagnosis results.Conclusion The carrying rate of αβ compound thalassemia is higher among population in Guangzhou area.Simultaneously conducting the α and β gene detection in the β-thalassemia carriers has an important significance to accurately conduct the genetic counseling and prenatal diagnosis.

α-thalassemia; β-thalassemia; gene diagnosis; prenatal diagnosis

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2006BAI05A02,2012BAI09B01)；廣東省計(jì)生委基金資助項(xiàng)目(2012208、20132031)；廣東省科技廳科技基礎(chǔ)條件建設(shè)資助項(xiàng)目(2010B060100014)。

屈艷霞，女，助理研究員，碩士，研究方向是遺傳與優(yōu)生。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.003

A

1672-9455(2015)22-3297-03

2015-06-12

2015-09-14)