連淑芬

(上海德濟醫(yī)院檢驗科 200331)

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·論 著·

抗水通道蛋白-4抗體應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的鑒別診斷價值

連淑芬

(上海德濟醫(yī)院檢驗科 200331)

目的 探討血清抗水通道蛋白-4(AQP-4)抗體應(yīng)用于多發(fā)性硬化和視神經(jīng)脊髓炎患者疾病診斷的臨床意義。方法 選擇2013年3月至2014年10月該院收治的74例多發(fā)性硬化以及視神經(jīng)脊髓炎患者,回顧性分析其臨床資料,對血清中AQP-4抗體水平進行檢查。結(jié)果 視神經(jīng)脊髓炎疾病患者各類型的陽性率分別為視神經(jīng)炎(ON)51.89%、長節(jié)段橫貫性脊髓炎(LETM)68.42%、視神經(jīng)脊髓型多發(fā)性硬化(OSMS)57.14%、視神經(jīng)脊髓炎(NMO)81.25%;而傳統(tǒng)型多發(fā)性硬化(CMS)患者的AQP-4抗體檢測為陰性。視神經(jīng)脊髓炎疾病譜的患者脊髓受累均大于3個椎體節(jié)段；多發(fā)性硬化脊髓受累均小于3個節(jié)段。視神經(jīng)脊髓炎多為急性或亞急性起病,多見于中年女性,發(fā)病年齡平均(42.1±13.9)歲,與CMS比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AQP-4抗體對于視神經(jīng)脊髓炎敏感性為81.25%,特異性為100.00%。結(jié)論 AQP-4抗體可以作為視神經(jīng)脊髓炎疾病以及多發(fā)性硬化鑒別診斷的重要指標。

視神經(jīng)脊髓炎； 多發(fā)性硬化； 水通道蛋白-4

視神經(jīng)脊髓炎(NMO)主要累及視神經(jīng)及脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一種炎性脫髓鞘病變，我國的發(fā)病率相比于歐美人群更高。大部分人認為NMO屬于多發(fā)性硬化(MS)的亞型，但是自從發(fā)現(xiàn)NMO的特性自身抗體及靶抗水通道蛋白4(APQ-4)后，才逐漸意識到兩種疾病的發(fā)病機制不同。NMO疾病譜包括了伴隨其縱向擴展的橫貫性脊髓炎(LETM)、視神經(jīng)脊髓型多發(fā)性硬化(OSMS),視神經(jīng)炎(ON)[1-2]。本研究旨在探討AQP-4抗體對NMO疾病譜疾病以及MS疾病的鑒別診斷價值，為臨床上AQP-4抗體檢測的開展提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年3月至2014年10月本院神經(jīng)內(nèi)科收治的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者74例,所有患者的診斷均依據(jù)MeDonald的相關(guān)診斷標準[3]或Wingerchuek中有關(guān)于視神經(jīng)脊髓炎的相關(guān)診斷標準[4]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準審核，隨訪方式為門診或電話方式。NMO患者的診斷需滿足以下條件：(1)OSMS；(2)無復(fù)發(fā)性視神經(jīng)炎(RON)；(3)脊髓病變大于3個節(jié)段；(4)伴有其他自身免疫性疾病的視神經(jīng)炎(ON)或是脊髓炎(TM)。MS患者排除NMO，符合2005年的MS診斷標準[5]，本研究74例患者中ON患者19例(ON組)，LETM患者19例(LETM組)，OSMS患者7例(OSMS組)，NMO患者16例(NMO組)，MS患者13例(MS組)，5組患者性別、發(fā)病年齡、復(fù)發(fā)次數(shù)、殘疾狀態(tài)擴展評分表(EDSS)評分等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 MS及NMO患者的臨床資料對比

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫建立及標本收集 建立患者數(shù)據(jù)庫及組織標本庫,收集影像資料，血清學標本,血清標本置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 APQ-4抗體測定

1.2.2.1 儀器與試劑 低溫高速離心機、Multiskan FC酶標儀(Thermo Scientific公司生產(chǎn))，人AQP-4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)。

1.2.2.2 原理 采用雙抗體夾心法測定標本中的人AQP-4水平。用純化的AQP-4抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入AQP-4，再與HRP標記的AQP-4抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB染色。TMB在辣根過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的AQP-4呈正相關(guān)，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中AQP-4的濃度。

1.2.2.3 血清樣本處理及要求 室溫血液自然凝固10～20 min(2 000～3 000 r/min)，仔細收集上清于-20 ℃冷凍保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。保存過程中出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

1.2.2.4 操作過程 (1)標準品的稀釋與加樣：每次測定的同時做標準曲線，最好做復(fù)孔。在酶標包被板上設(shè)標準孔10孔，稀釋后各孔加樣量都為50 μL,濃度分別為30、20、10、5、2.5 μg/L，重復(fù)2次。(2)加樣：分別設(shè)空白孔及樣品孔，樣品孔加樣品稀釋液40 μL及10 μL樣品，輕輕晃動混勻。(3)溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。(4)洗滌：用配好的洗滌液重復(fù)洗滌5次，拍干。(5)加酶：每孔加入酶標試劑50 μL,空白孔除外。(6)溫育：操作同步驟(3)。(7)洗滌：操作同步驟(4)。(8)顯色：每孔加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃遮光顯色15 min。(9)每孔加終止液50 μL,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)為黃色)。(10)以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的OD值。測定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進行。

1.2.2.5 計算 以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；標準或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組抗體陽性率比較 在5組患者中,NMO組患者陽性率最高81.25%,其余依次為LETM組、ON組、OSMS組、CMS組,且CMS組與NMO組的AQP-4陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AQP-4抗體對于NMO的敏感性為81.25%,特異性為100.00%。見表2。

2.2 AQP-4抗體陽性與陰性疾病組影像學特點對比 AQP-4陽性患者脊髓MRI特點：AQP-4抗體陽性患者共出現(xiàn)34例出現(xiàn)脊髓異常,其中27例大于3個椎體節(jié)段病變,對稱性以及橫貫性受損,AQP-4抗體陰性患者脊髓受累情況小于3,且多為偏側(cè)受損。

表2 各組患者AQP-4陽性率比較(n或%)

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性病變的主要癥狀為神經(jīng)髓鞘的脫失，其中MS是一種發(fā)生于青年人群中的常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘疾病,該病有著豐富的臨床表現(xiàn),具體根據(jù)其累及的中樞神經(jīng)系統(tǒng)部位而呈現(xiàn)特異性表現(xiàn),患病后患者可出現(xiàn)肢體無力，感覺異常，共濟失調(diào)等癥狀[6]。

MRI影像學技術(shù)已被廣泛用于兩種疾病的診斷，但是MRI只能夠分析病灶數(shù)量量性標準,無法對MS及其他類型的復(fù)發(fā)緩解性神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行區(qū)分,MS因其多變的臨床表現(xiàn),使其和其他中樞系統(tǒng)脫髓鞘性疾病很難鑒別。

Lennon等[7]2004年應(yīng)用間接免疫熒光法檢測了NMO患者的血清中存在著特異性抗體,他們將這種技術(shù)應(yīng)用于NMO患者的抗體檢測,敏感性為73%,特異性為91%,而MS患者血清的該抗體為陰性,Saiz等[8]也研究了NMO及MS患者血清NMO-IgG抗體水平,發(fā)現(xiàn)NMO-IgG敏感性達到了76%,特異性達到94%，所以NMO是一種獨立疾病,但是二者的發(fā)病機制卻是不同,該抗體檢測可以對于NMO及MS予以鑒別，通過其進一步的研究發(fā)現(xiàn)NMO-IgG可以與腦內(nèi)軟腦膜以及微血管成分進行特異性結(jié)合,且AQP-4蛋白與小鼠脊髓膠質(zhì)——液體界面的分布和NMO-IgG結(jié)合位點是相一致的[9]，所以AQP-4抗體可以作為NMO診斷的特異性診斷指標。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NMO疾病譜中各組患者的陽性率分別為NOM(81.25%)、LETM(68.42%)、ON(51.89%)、OSMS(57.14%),均較CMS組明顯增高,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Waters等[10]應(yīng)用間接熒光免疫測定AQP-4的結(jié)果也證實了視神經(jīng)脊髓炎的抗體陽性率達到了73%，多發(fā)性硬化為9%,與本研究的結(jié)果相似。

同時研究中發(fā)現(xiàn)：(1)多為急性起?。?2)常見于中年女性,平均(41.0±15.4)歲,與CMS組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；(3)患者可出現(xiàn)自身免疫病,如干燥綜合征等；(4)典型的脊髓受累主要為頸髓,多在3個椎體節(jié)段以上受累,且呈橫貫性,而MS組的脊髓受累則在3個椎體節(jié)段以下,呈非對稱性分布。

綜上所述,NMO是一類獨立的疾病，AQP-4抗體檢測技術(shù)可以作為其區(qū)別于別于MS的特異性指標。

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Clinical value of application of AQP-4 antibody in differentiation diagnosis of central nervous system demyelination diseases

LIANShu-fen

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiDejiHospital,Shanghai200331,China)

Objective To explore the clinical significance of the application of serum aquaporin-4(AQP-4) antibody in the diagnosis of multiple sclerosis and neuromyelitis opica(NMO).Methods 74 cases of multiple sclerosis and NMO in this hospital from March 2013 to October 2014 were selected and their clinical data were retrospectively analyzed.The serum AQP-4 antibody was detected.Results The AQP-4 antibody positive rates of various types of NMO were 51.89% for optic neuritis(ON),68.42% for long segment transverse myelitis (LETM),57.14% for opticospinal multiple sclerosis (OSMS) and 81.25% for NMO;but the AQP-4 antibody detection in the conventional multiple sclerosis(CMS) was negative.(2)In the patients of NMO disease spectrum,the spinal cord was involved more than 3 vertebral segments;while in multiple sclerosis,the involved spinal cord was less than 3 segments.(3) NMO was mostly acute or subacute onset,more common in middle-aged women,the mean age at the onset was (42.1±13.9) years,the difference between NMO and CMS had no statistical difference(P>0.05).Conclusion AQP-4 antibody can be used as an important index of the differentiation diagnosis between NMO and multiple sclerosis.

neuromyelitis optica; multiple sclerosis; aquaporin-4

連淑芬，女，本科，主管檢驗師/主管輸血技師，主要從事腦科檢驗方面工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.032

A

1672-9455(2015)14-2051-02

2015-03-25

2015-04-15)