溫苑章，徐繼威，宋 越，張賀云，周嘉嘉，陳汝福，王 捷△

(1.廣東省梅州市人民醫(yī)院普外一科 514089；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科，廣州 510120)

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·論 著·

載吉西他濱磁性含鐵納米微球治療胰腺癌細(xì)胞的體外研究

溫苑章1，徐繼威1，宋 越1，張賀云2，周嘉嘉2，陳汝福2，王 捷2△

(1.廣東省梅州市人民醫(yī)院普外一科 514089；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科，廣州 510120)

目的 制備載吉西他濱磁納米微球(Gem-CCMN)，考察其協(xié)同恒定外磁場(chǎng)下對(duì)人胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2的體外殺傷效應(yīng)。方法 采用化學(xué)共價(jià)耦聯(lián)法制備Gem-CCMN，掃描電子纖維鏡(SEM)觀(guān)察納米粒形態(tài)，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定載藥量及包封率，體外考察 Gem-CCMN在擬溶菌酶存在的不同pH值下藥物累積釋放率，MTT法檢測(cè)協(xié)同恒定外磁場(chǎng)下 Gem-CCMN對(duì)CAPAN-2體外增殖的抑制效應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)(FCS)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 Gem-CCMN呈球形，平均粒徑約為50 nm，載藥量為15%，包封率為45%，pH=7時(shí)48 h累積釋放量?jī)H25%，pH=2時(shí)藥物累計(jì)釋放率可達(dá)84%；Gem-CCMN協(xié)同外磁場(chǎng)時(shí)可增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。結(jié)論 Gem-CCMN聯(lián)合外磁場(chǎng)可有效抑制 CAPAN-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

吉西他濱； 納米； 胰腺癌； CAPAN-2； 殺傷

吉西他濱(Gem)是食品和藥物管理局批準(zhǔn)的用于治療進(jìn)展期胰腺癌的一線(xiàn)用藥，對(duì)胰腺癌單一或聯(lián)合其他抗癌藥物都取得很高的療效[1]。但Gem不良反應(yīng)大，體內(nèi)代謝快，血漿半衰期短，僅 1.5 h。磁導(dǎo)向抗腫瘤靶向治療是一種新興的腫瘤靶向治療方法，將化療藥物、磁性?xún)?nèi)核包入高分子材料中制成的納米微球中，注入體內(nèi)后，在體外磁場(chǎng)的作用下滯留于靶區(qū)，平穩(wěn)釋放藥物殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)降低藥物不良反應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)以生物可降解材料羧甲基殼聚糖為原料，包裹磁性納米 Fe3O4，采用化學(xué)共價(jià)耦聯(lián)法制備吉西他濱-羧甲基殼聚糖氧化鐵納米微球(Gem-CCMN)，考察協(xié)同恒定外磁場(chǎng)條件下，對(duì)人胰腺癌細(xì)胞 CAPAN-2 的體外殺傷效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鹽酸Gem購(gòu)自上海英軒醫(yī)藥科技有限公司；自制枸櫞酸鈉穩(wěn)定的磁流體(30 mg/mL)，正硅酸乙酯(TEOS)、3-三乙氧基硅基甲基丙烯酸酯(MPS)、N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)均購(gòu)自汕頭市光華化學(xué)廠(chǎng)；RPMI 1640為美國(guó) Gibco 產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；Annexin-V/PI 雙染試劑盒購(gòu)于深圳晶美公司；胰腺癌細(xì)胞 CAPAN-2 購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。EQUINOX55 型傅立葉變換紅外光譜儀(德國(guó) Bruker公司)；掃描電子纖維鏡(SEM,QUANTA 400，UK)；Spectrumlab52 型紫外分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；Model-680 酶標(biāo)儀購(gòu)于北京金輝盛業(yè)科技有限公司；FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó) BD 公司；釹鐵硼稀土永磁體購(gòu)于廣州釹磁鐵廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 磁性馬來(lái)?；燃谆鶜ぞ厶俏⑶?CCMN)的制備 取2.0 mL磁流體超聲分散于200 mL含有5.0 mL 氨水的醇/水(V/V=4∶1)的混合液中，機(jī)械攪拌下將混合體系升溫至40 ℃，并加入TEOS 0.5 mL反應(yīng)12 h，在外加磁場(chǎng)作用下(6 000 G)收集產(chǎn)物Fe3O4@SiO2，去離子水和乙醇反復(fù)洗滌后分散于含有2.0 mL 氨水的乙醇中，加入過(guò)量的MPS,室溫下機(jī)械攪拌48 h 后，外加磁場(chǎng)作用下(6 000 G)從反應(yīng)液中分離產(chǎn)物Fe3O4@SiO2@MPS，去離子水反復(fù)洗滌并分散于去離子水中，濃度為20 mg/mL；取 2.0 mL 的Fe3O4@SiO2@MPS分散液，加入到含有MCS 0.04 g 和KPS 5 mg的水溶液中，機(jī)械攪拌分散，通氮?dú)?0 min后，升溫至70 ℃反應(yīng)4 h后于外加磁場(chǎng)作用收集產(chǎn)物CCMN，并用去離子水多次洗滌，并重新分散于水中，濃度為20 mg/mL。

1.2.2 Gem-CCMN的制備 在室溫下，取Gem鹽酸鹽(0.37 g，1.2 mmol)溶于5 mL含有EDC 0.5 g 和NHS 0.1 g的水溶液中，并將該反應(yīng)液滴加于 5 mL 上述CCMN 的分散液中，避光機(jī)械攪拌反應(yīng)48 h，反應(yīng)結(jié)束后，在外加磁場(chǎng)作用下得到產(chǎn)物，去離子水反復(fù)洗滌后，放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)在-40 ℃下真空干燥，稱(chēng)質(zhì)量，備用。

1.2.3 Gem-CCMN納米特征檢測(cè) 將真空干燥后的Gem-CCMN微球與KBr 研磨并壓片，在傅立葉變換紅外光譜(FTIR，Nicolet，USA)測(cè)定紅外透射譜圖。將真空干燥后的Gem-CCMN微球滴在玻璃片上，自然干燥后表面噴金處理，用SEM 觀(guān)察形態(tài)、粒徑及粒徑分布。

1.2.4 Gem-CCMN載藥量及接枝率測(cè)定 取2 mL上述反應(yīng)后的液體，離心，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在267.6 nm下的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算殘液中Gem的含量，根據(jù)公式計(jì)算Gem-CCMN的包封率及載藥量，公式如下。公式：包封率=(Gem總量-殘液Gem含量)/Gem總量×100%；載藥量=(Gem總量-殘液Gem含量)/ Gem-CCMN重量×100%。

1.2.5 Gem-CCMN的體外藥物釋放 取Gem-CCMN 0.5 mg加入5 mL濃度為0.1 mg/mL的胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，并在37 ℃的恒溫水浴中振蕩，分別加入1.0 mol/L的HCl或1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至2、3、4、5、7.4，培育不同時(shí)間后，用6 000 G磁場(chǎng)及2 000 r/min離心分離出上層懸浮液，測(cè)定其在267.6 nm下的吸收度值，取3次實(shí)驗(yàn)平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出懸浮液中Gem的累積釋放量。

1.2.6 MTT法測(cè)定Gem-CCMN對(duì)胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2的增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAPAN-2細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后制成1×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，200 微升/孔，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為a：NS陰性對(duì)照組；b：CCMN空載對(duì)照組；c：?jiǎn)渭兇艌?chǎng)組；d：Gem陽(yáng)性對(duì)照組；e：Gem-CCMN治療組；f：Gem-CCMN聯(lián)合磁場(chǎng)治療組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每個(gè)亞組設(shè)5個(gè)平行孔。磁場(chǎng)強(qiáng)度為6 000 G，藥物組含Gem量為16 μg/mL。培養(yǎng)48 h后，加MTT(5 mg/mL)20微升/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸除各孔原液，加入二甲基亞砜(DMSO)150微升/孔，振蕩混勻10 min，酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)定492 nm各孔A值。計(jì)算各組的增殖抑制率。抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/陰性對(duì)照組平均A值×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAPAN-2 凋亡 CAPAN-2細(xì)胞以1×105/mL細(xì)胞懸液孔接種于6孔板內(nèi)，無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期同步化。每孔分別加入含Gem(16 μg/mL)的培養(yǎng)液，以NS為空白對(duì)照(A)，分為單純Gem治療組(B)、Gem-CCMN組(C)以及Gem-CCMN聯(lián)合磁場(chǎng)治療組(6 000 G)(D)。培養(yǎng)48 h后胰酶消化收集細(xì)胞，PBS吸兩遍，結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，取195 μL 的細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V/FITC，室溫避光孵育10 min，190 μL結(jié)合緩沖液洗滌并重新懸浮細(xì)胞后，加入10 μL、20 μg/mL 的PI，每組重復(fù)3 次，1 h內(nèi)檢測(cè)凋亡和壞死細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 Gem-CCMN的紅外光譜圖 從紅外光譜中看到在1 621 cm-1和1 529 cm-1處出現(xiàn)了兩個(gè)尖銳的峰是-CONH-的特征吸收峰，提示Gem在EDC的作用下其氨基和磁性粒子表面的羧基進(jìn)行了反應(yīng)。591 cm-1處為Fe的特征吸收峰。見(jiàn)圖1。

圖1 Gem-CCMN的紅外光譜圖

2.2 Gem-CCMN載藥量及接枝率測(cè)定 經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定Gem-CCMN載藥量約為15%，接枝率約為45%。

2.3 Gem-CCMN的SEM形態(tài) 從SEM照片中可以看出制備Gem-CCMN為球形或近似球形納米粒子，粒徑較均勻，平均直徑約為50 nm。

2.4 Gem-CCMN體外藥物釋放 各組的累積藥物釋放率見(jiàn)圖2。從圖中可見(jiàn)微球12 h 就能達(dá)到藥物的最大釋放率，pH=2時(shí)藥物 48 h 最大的累積釋放率達(dá)84%，而 pH=7.4時(shí)僅為25%。表明Gem-CCMN在 pH=7.4時(shí)較為穩(wěn)定，而 pH=2 時(shí)溶菌酶活性高，可充分水解Gem-CCMN的肽鍵(-CONH-)釋放Gem。

圖2 各組的累積藥物釋放率

2.5 MTT法測(cè)定Gem-CCMN對(duì)胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2的增殖抑制率 各組的CAPAN-2增殖抑制率見(jiàn)表1。通過(guò)單因素方差分析，結(jié)果表明Gem及Gem-CCMN均明顯抑制CAPAN-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而Gem-CCMN聯(lián)合磁場(chǎng)對(duì)CAPAN-2的抑制作用明顯高于其他治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但CCMN空載治療組與NS治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示CCMN作為藥物載體具有良好的生物相容性。各組CAPAN-2細(xì)胞活力，Gem-CCMN聯(lián)合磁場(chǎng)處理CAPAN-2細(xì)胞活力明顯高于其他治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 CAPAN-2增殖抑制率MTT分析

注：f組與其他組比較，P<0.05；d組和e組比較，P>0.05；a組和b組比較，P>0.05。-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAPAN-2凋亡 各組的CAPAN-2的凋亡壞死率見(jiàn)表2。從表2中可以看出，B、C、D組細(xì)胞凋亡、壞死率均高于A(yíng)組(P<0.05)，B組與C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而D組凋亡、壞死率均高于其他治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示Gem-CCMN聯(lián)合磁場(chǎng)可明顯誘導(dǎo)CAPAN-2 細(xì)胞發(fā)生凋亡及壞死。

表2 CAPAN-2凋亡率和壞死率流式細(xì)胞術(shù)分析

3 討 論

3.1 Widder早在1978年就提出“磁控納米靶向載藥系統(tǒng)”的概念[3]。近幾十年來(lái)隨著生物技術(shù)以及納米技術(shù)的飛速發(fā)展，磁控納米載藥系統(tǒng)的研究發(fā)展到了一個(gè)新的高度，但良好的生物相容性仍是納米醫(yī)用材料的首要必備條件[4]。本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖是天然堿性多糖,是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物,具有良好的生物相容性和生物可降解性,在體內(nèi)能被溶菌酶等降解,降解產(chǎn)物能完全被人體吸收,無(wú)不良反應(yīng)[5]。而選用的鐵磁流體乃人體必需元素，少量應(yīng)用對(duì)人體無(wú)不良反應(yīng)[6]。而MTT結(jié)果也顯示：?jiǎn)渭兊腃CMN納米微球?qū)APAN-2 細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，提示CCMN可作為良好的靶向給藥載體。

3.2 Gem又名2′-脫氧-2′,2′-二氟胞苷，是一種具有抗癌活性的脫氧胞苷酸類(lèi)似物，屬細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥，是臨床治療胰腺癌的有效藥物之一[7-9]。Gem在進(jìn)入細(xì)胞之前通常以無(wú)活性的形式存在，在細(xì)胞內(nèi)由核苷激酶代謝成有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)和三磷酸核苷(dFdCTP)，聯(lián)合抑制細(xì)胞DNA的合成[10]。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)共價(jià)耦聯(lián)的方法，通過(guò)肽鍵(CONH)將Gem共價(jià)耦聯(lián)于CCMN微球上，制備出Gem-CCMN納米微球，其平均粒徑約為50 nm，載藥量達(dá)15%，具有磁響應(yīng)性強(qiáng)以及長(zhǎng)時(shí)間藥物緩釋的優(yōu)點(diǎn)；體外釋放實(shí)驗(yàn)證實(shí)Gem-CCMN可避免在生理pH=7.4條件下被降解，可保證Gem-CCMN以有活性形式釋放于細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)靶向給藥的目的，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，增加療效。同時(shí)該納米微球保持Gem抗癌活性，MTT結(jié)果顯示Gem-CCMN對(duì)CAPAN-2的增殖有明顯的抑制作用，和相同濃度的Gem治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也證實(shí)Gem-CCMN具有良好的抑瘤作用，聯(lián)合磁場(chǎng)可明顯增加Gem-CCMN的抑瘤作用(P<0.05)，除Gem-CCMN具有緩釋效果外，磁場(chǎng)還可通過(guò)影響細(xì)胞生物膜的電位、通透性以及酶活性的改變，以增加藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)制備了一種新的磁納米載藥體系Gem-CCMN，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的安全、緩釋、磁響應(yīng)性，能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及壞死，為進(jìn)一步的體內(nèi)磁靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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In vitro study on gemcitabine carryingg iron-containing magnetic nanoparticles in treating pancreatic carcinoma cells

*WENYuan-zhang1,XUJi-wei1,SONGYue1,ZHANGHe-yun2,ZHOUJia-jia2,CHENRu-fu2,WANGJie2△

(FirstDepartmentofGeneralSurgery,MeizhouMunicipalPeople′sHospital,Meizhou,Guangdong514089,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To prepare the gemcitabine carrying magnetic nanoparticles (Gem-CCMN) and to investigate their in vitro killing effects on pancreatic carcinoma cell line CAPAN-2 in collaboration of the constant external magnetic fields.Methods Gem-CCMN was prepared by the chemical covalent linkage coupling procedure.Its morphology was observed by scanning electron microscope(SEM).The drug loading amount and encapsulating ratio were determined by the ultraviolet spectrophotometry.The accumulating release rate of Gem-CCMN under different pH values in the existence of lysozyme was investigated in vitro.The in vitro growth inhibiting effect of Gem-CCMN on CAPAN-2 under the collaborative constant external magnetic field was detected by the MTT assay.The apoptosis of CAPAN-2 was detected by the flow cytometry.Results Gem-CCMN were spherical with average diameter of 50 nm,the drug loading amount was 15% and the encapsulating ratio was 45%.The 48 h cumulative drug release amount at pH=7 was only 25%,but which at pH=7 could reach 84%;Gem-CCMN collaborated with external magnetic fields could enhance the killing effect on CAPAN-2,also induced the cellular apoptosis and necrosis.Conclusion Gem-CCMN combined with external magnetic fields could effectively inhibit the growth of CAPAN-2 in vitro.

gemcitabine; nanoparticles; pancreatic carcinoma; CAPAN-2; killing

國(guó)家重大專(zhuān)項(xiàng)課題 (2012ZX10002～016)；中山大學(xué)臨床研究5010項(xiàng)目(2010009)。

溫苑章,男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楦文懸认倌[瘤的診治?！?/p>

，E-mail：wangjiesunyatsen@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.003

A

1672-9455(2015)14-1984-03

2015-02-20

2015-03-15)